[发明专利]一种用酶法制备UDP的方法

说明书

本发明公开了一种用酶法制备UDP的方法，将尿苷、糖类碳源、无机离子与酵母混合、并以大肠杆菌产生重组表达的尿苷二磷酸酶作为催化剂进行保温发酵，得到尿苷二磷酸发酵液；然后进行冰块降温预处理，并通过分离提纯；再将纯化后的尿苷二磷酸进行醇沉结晶，最后进行干燥、粉碎处理。本发明通过酵母与基因工程菌的联合作用，简便、经济、合理地大量合成尿苷二磷酸，可以获得纯度非常高的目标化合物，简化了生产工艺，适合于工业化生产。

技术领域

本发明涉及一种用酶法制备UDP的方法，具体地说，是以尿苷为原料，加入大肠杆菌重组表达蛋白提取物和无机离子混合发酵，然后通过微滤、树脂分离除杂、纳滤除盐、树脂脱色和醇沉等进行纯化生产尿苷二磷酸(UDP)的方法。

背景技术

上世纪六、七十年代，我国开始以核苷一磷酸为原料，利用酵母发酵生产核苷三磷酸 (NTP)，主要生产腺苷三磷酸(ATP)和胞苷三磷酸(CTP)。利用酵母发酵生产ATP的研究较多，在七、八十年代已有较稳定的发酵生产工艺，并能进行小规模的生产。但这种发酵生产ATP、CTP等的工艺过程还存在很多的弊端，比如工艺复杂、操作繁琐、生产成本高，而且不适合大规模生产。主要原因如下：

1、发酵底物浓度低,一般低于2％或20mg/ml，所得产物量不高，因而导致发酵设备利用率低，劳动生产率低，使生产成本增加。

2、发酵液预处理工艺不合理，使用离心分离和酒精沉淀再回溶的法，能耗大，时间长，回收率低。

3、分离纯化工艺不合理，分离纯化中采用的方法和使用的设备已落后，使周期长，回收率低，产品质量低，成本增加。

尿苷二磷酸(UDP)是合成阿普林津(Ampligen)的原料之一。阿普林津是一种错配双链 RNA药物(Polyl:C12U)，具有抗病毒和免疫调节的双重作用，高效低毒。目前，在国外该药正在进行一些疾病的临床实验，包括慢性疲劳综合症、艾滋病、乙肝等。

对于尿苷二磷酸(UDP)和尿苷三磷酸(UTP)的制备方法很少有人进行深入的研究，只是其衍生物，尤其是UDP糖类由于药用广泛而引起国内外的重视。比如，专利文献98801453.X 公开了一种尿苷二磷酸N乙耽葡糖胶的制备方法，该方法使用微生物菌体，由尿苷酸(UMP) 和N乙耽葡糖胶制备尿苷二磷酸N乙耽葡糖胶(UDPAG)，并使N乙耽葡糖胶激酶共存。但到目前为止，国内仍没有高效率、低成本、操作简便的UTP和UDP生产工艺。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用酶法制备UDP的方法。所述方法包括：在一个体外(细胞外) 反应系统中，以尿苷、糖类碳源为底物，加入无机离子与酵母，以大肠杆菌重组表达的尿苷二磷酸酶作为催化剂，通过生物转化产生尿苷二磷酸发酵液。然后将所述的尿苷二磷酸发酵液进行冰块降温预处理，并通过分离提纯；再将纯化后的尿苷二磷酸(UDP)进行醇沉结晶，最后进行干燥、粉碎处理。

作为本发明的优选方式，酵母菌体需要进行通透性处理。酵母菌体的通透处理可使用表面活性剂、有机溶剂。表面活性剂包括Triton-X100、NymeenS-215、烷基二甲胺等，促进酵母细胞通透性和UDPG生成的物质均可使用，可单独使用或多种混合使用。表面活性剂以0.1～ 50g/Kg的浓度使用，优选以1～20g/Kg的浓度使用。有机溶剂可使用二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮、乙酸乙酯等，以1～60ml/Kg的浓度使用，优选以2～10ml/Kg的浓度使用。