[发明专利]一种基于无缝克隆技术的基因定点突变方法及其应用

权利要求书

1.一种基于无缝克隆技术的基因定点突变方法，其特征在于：通过设计两对引物扩增构建单位点突变质粒，其中一对引物是根据突变位点处的序列分别设计5′端包含互补同源臂序列的正向突变引物和反向突变引物，突变位点可位于同源臂中任一位置；另一对引物是在质粒的非突变位点区分别设计5′端包含另一互补同源臂的正向引物和反向引物，引物中同源臂大小为15-20bp；然后采用无缝克隆技术，将高保真酶扩增出的两个一端包含突变位点的片段进行无缝拼接，构建具有目标突变位点的环状质粒。

2.根据权利要求1所述的基于无缝克隆技术的基因定点突变方法，其特征在于：PCR扩增出的两个一端包含突变位点的片段，存在500bp以上的大小差异时，可确保无缝克隆的高效性。

3.根据权利要求1所述的基于无缝克隆技术的基因定点突变方法，其特征在于：对于多位点突变，要根据突变位点数设计出与位点数相同对数的5′端包含互补同源臂序列的突变引物，采用同源重组酶可将2-5个片段一步无缝拼接，构建具有多个突变位点的环状质粒。

4.根据权利要求1所述的基于无缝克隆技术的基因定点突变方法，其特征在于：PCR扩增质粒模板后，采用Dpn I酶体外降解甲基化的非突变型质粒模板；将利用无缝克隆技术构建的含目标突变位点的环状质粒转化到DMT感受态细胞中，DMT感受态细胞体内降解甲基化的非突变型质粒模板，从而有效筛选突变克隆。

5.一种基于无缝克隆技术的基因定点突变试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括包装盒、衬垫、试剂管和使用说明书，其组成成分包括：一、高保真DNA聚合酶预混液；二、Dpn I和10×Dpn I buffer；(3)无缝克隆酶和5×无缝克隆缓冲液；(4)DMT感受态细胞；(5)对照质粒和对照质粒的通用鉴定引物；(6)无菌ddH₂O。

6.一种基于无缝克隆技术的基因定点突变方法与试剂盒在分子生物学、遗传学与蛋白质工程等研究领域中的应用。