[发明专利]一种基于无缝克隆技术的基因定点突变方法及其应用

说明书

本发明涉及一种基于无缝克隆技术的基因定点突变方法、试剂盒及其应用。所述方法步骤如下：根据突变位点处的序列分别设计5′端包含互补同源臂序列的正向和反向突变引物，突变位点可位于同源臂中任一位置；在质粒的非突变位点区分别设计5′端包含另一互补同源臂的正向和反向引物，PCR扩增出的两个一端包含突变位点的片段，需存在500bp以上的大小差异；对于多位点突变，根据突变位点数设计出与位点数相同对数的突变引物；采用同源重组酶将2‑5个片段一步无缝拼接，构建具有目标突变位点的环状质粒。所述方法相对经典的重叠延伸PCR法，具有快速简便，可对小于40kb质粒任意位置实现单点或多点、连续或不连续突变，突变效率达100％的特点。

技术领域

本发明涉及一种基于无缝克隆技术的基因定点突变方法，基于该方法制备的基因定点突变试剂盒及其应用的具体实施方案，属于基因工程技术领域。

背景技术

基于PCR技术的基因定点突变是分子生物学和蛋白质工程中研究基因调控、蛋白质结构与功能必不可少的工具。基因定点突变方式主要包括碱基替换、删除、插入，多位点突变，一个或多个位点的随机突变。许多基于PCR技术的基因定点突变方法已被商业化，其中最普遍使用的方法包括以下几种：

(1)重叠延伸PCR法(overlap extension method)。该方法中使用的正反引物含有互补的重叠区。采用重叠延伸PCR技术扩增获得的产物是一种含有靶突变位点、有开口的、松弛的环状质粒(Sun SH,Huang H,Billy Qi YC,Qiu MS and Dai ZM.Complementaryannealing mediated by exonuclease:a method for seamless cloning andconditioning site-directed mutagenesis.Biotechnology&BiotechnologicalEquipment.2015,29(1):105-110)；

(2)大引物PCR法(megaprimer method)。该方法一般需要三条引物，首先由突变引物和相应的外侧引物进行第一轮PCR反应得到大引物，经纯化后与另一外侧引物进行第二轮PCR获得目的片段(Ke SH and Madison.Rapid and efficient site-directedmutagenesis by single-tube‘megaprimer’PCR method.Nucleic Acids Research.1997,25(16):3371-3372)；

(3)快速更换法(Quick Change Method(Agilent Technologies,La Jolla,CA,USA))。快速更换法是使用一对含有部分或完全互补重叠区的引物，结合PfuTurbo DNA聚合酶扩增环状质粒。PCR指数扩增产生的单链DNA分子会在退火时，通过交叉切断单链DNA产生环状质粒(Xia YZ,Chu WQ,Qi QS and Xun LY.New insights into the QuikChangeprocess guide the use of Phusion DNA polymerase for site-directedmutagenesis.Nucleic Acids Research.2015,43(2):2-9)。

但这些方法也存在如下不足之处：

(1)当PCR扩增产物浓度低时，突变质粒的构建效率很低；

(2)高保真DNA聚合酶具有微弱的链置换反应活性，它可能会引发链置换反应，并将该产物指数扩增放大化；

(3)细胞生物学实验中常用的工具质粒都比较大，比如四环素诱导的基因过表达载体pLVX-Tight-Puro大小为7791bp，荧光素酶报告系统载体pmirGLO大小为7350bp。使用一对引物有时难以扩增出上述包含目的基因的重组载体，需要购买价格昂贵、具有长片段扩增能力的高保真酶；