[发明专利]一种具有生物活性的COX18多肽及其合成方法与用途

权利要求书

1.一种具有生物活性的COX18多肽，该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：LLPAGWILSH LETYRRPE。

2.权利要求1所述COX18多肽的固相合成方法，其特征在于所述固相合成方法包括以下步骤：

(1)、缩合反应：使用DMF预溶胀树脂，滤去溶剂备用；向反应柱中加入脱保护试剂，反应后脱去树脂上的的FMoc保护基团，抽干，继续采用DMF清洗后抽干，并检测；

称取第一个Fmoc-氨基酸Fmoc-GLu(tBu)-OH，同时称取HOBt备用，将二者同时加入反应柱中，并且溶于DCM中，然后加入DIC并搅拌；称取DMAP投入反应柱中；氨基酸与反应试剂一同反应，反应完毕后抽干并用DMF清洗；向反应柱中加入脱保护试剂，反应后，脱去树脂上的的FMoc保护基团，抽干，继续采用DMF清洗后抽干，并检测；

接下来的按照COX18多肽的顺序重复添加肽链上的下一氨基酸，直至整条肽链18个氨基酸全部添加完成并检测通过；全部完成后，使用无水甲醇清洗并使用抽滤瓶将其抽干；

(2)、肽链的切割：在抽干的合成肽树脂中加入切割液，在通风橱中室温搅拌裂解，使用砂芯漏斗过滤除去树脂，收集滤液，滤液经乙醚萃取后放置于干燥瓶内进行干燥，直至其成为白色粉末，即制得多肽粗品；

(3)、粗肽的检测和纯化：利用高效液相色谱检测合成的多肽粗品，并分析合成产物中多肽的纯度；

(4)、肽的质谱鉴定：用质谱检测多肽粗品的分子量，确定合成的多肽是否是目标产物，最后将收集的样品用三氟乙酸和水溶解制成溶液倒入样品杯中，冷冻过夜，次日用真空干燥剂冷冻干燥，最后获得的白色粉末状物质即为纯品COX18多肽。

3.根据权利要求2所述的固相合成方法，其特征在于：步骤(1)中所述脱保护及缩合反应的检测方法如下：检测时分别取三滴5％茚三酮无水乙醇溶液和三滴80％苯酚无水乙醇溶液与待检测树脂颗粒充分混匀，105℃加热5m in，观察颜色变化，若变蓝色或紫色，则说明游离氨基存在，脱保护完全；若为亮黄色或无色则表示缩合完全，能够继续进行下一个缩合反应。

4.根据权利要求2所述的固相合成方法，其特征在于：步骤(1)中在合成每一个氨基酸时，反应过程中维持温度在25℃～28℃。

5.根据权利要求2所述的固相合成方法，其特征在于：步骤(2)中萃取的步骤为：在滤液中按1：10的体积比加入事先4℃下预冷的乙醚，进行萃取，再以每分钟3000转的速度离心2分钟，并使用乙醚清洗离心管，清洗3次，每次清洗都配合有2分钟离心。

6.根据权利要求2所述的固相合成方法，其特征在于：步骤(3)中高效液相色谱检测的方法为：取多肽粗品置于EP管，加入三氟乙酸和水，于超声振荡机中震荡使多肽粗品溶解，用C18分析柱进行HPLC，流动相：A相：乙腈，0.1％TFA；B相：水，0.1％TFA，洗脱梯度：B相的浓度从90％到0，洗脱速度1mL/min，洗脱时间25min，检测波长220nm。

7.根据权利要求2所述的固相合成方法，其特征在于：步骤(4)中质谱分析采用ESI正离子模式，离子电压为8000v，碰撞气体为N2，脱溶剂气温度350e，注射泵进样速度为10uL/min。

8.权利要求1所述的COX18多肽的用途，其特征在于：用于制备抑制糖诱导的胰岛素的分泌、抵抗胰岛素耐受、抵抗高胰岛素血症和减轻体重的药物中。