[发明专利]水蛭素靶向定位释放基因给药系统及其制备方法和用途

说明书

本发明公开了一种水蛭素靶向定位释放基因给药系统，该给药系统为纳米基因给药系统，包括给药载体以及分泌表达质粒，所述分泌表达质粒由真核表达分泌型质粒载体pSecTag2A和重组水蛭素基因组成，所述重组水蛭素基因是在水蛭素蛋白的编码基因的N端依次连接凝血因子活性形式Xa(FXa)识别序列和精氨酰‑甘氨酰‑天冬氨酸(RGD)序列，水蛭素蛋白的编码基因的C端依次连接凝血因子活性形式Xa(FXa)识别序列和增强绿色荧光蛋白(EGFP)的编码基因而得到。本发明是重组水蛭素融合蛋白血栓靶向和血栓部分定点激活的长效缓释双重靶向定位释放的纳米DNA制剂。

技术领域

本发明属于生物治疗与生物医药技术领域，特别是涉及水蛭素靶向定位释放基因给药系统及其制备方法和用途。

背景技术

水蛭素的结构和活性研究显示，它的N末端延伸会使水蛭素丧失抗凝血活性的特点，而C末端的延伸对其活性影响不大。如果在水蛭素蛋白链的N端接上血栓靶向肽，可暂时封闭水蛭素的活性，使它能够在特定部位激活后恢复活性，减少出血风险；在水蛭素蛋白链的C端接上荧光蛋白，可在保持水蛭素活性的条件下，便于体内跟踪检测。

血栓形成过程涉及到血小板血栓形成、体内凝血系统及纤维蛋白溶解系统激活等多个方面，血小板聚集形成血小板血栓在整个血栓形成过程中起到了核心作用，而纤维蛋白原(Fibrinogen，Fg)和活化血小板膜糖蛋白(Glycoprotein,GP)IIb/IIIa受体的特异性结合是引起血小板聚集的最终共同通道之一。血小板膜糖蛋白IIb/IIIa受体即GP IIb/IIIa受体，又名整合素αIIbβ3受体，是整合素(integrin)家族受体中的一员。GP IIb/IIIa受体是一种膜结合蛋白，是血小板膜上最丰富的受体，正常情况下，此受体空间构象稳定。当血小板受外界刺激活化时，该受体空间构象发生改变，暴露Fg的识别部位，介导Fg和它的结合，完成血小板聚集过程。Fg是一种粘附蛋白，Fg中的精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)序列是Fg和活化的GPIIb/IIIa受体结合的活性位点，存在于其两条Aα链中(RGDF 95-98，RGDS 572-575)。含有RGD序列的物质均可与活化的GPIIb/IIIa受体结合，竞争性地抑制Fg和GPIIb/IIIa受体的结合，从而阻断血小板聚集和血栓的形成。只有血栓部位才存在活化的GPIIb/IIIa受体，因此RGD序列具有血栓靶向性和抗血小板聚集的作用。

凝血因子活性形式Xa(FXa)属于丝氨酸蛋白水解酶，它能激活凝血酶原变成有活性的凝血酶，是凝血过程中的一个关键因子，同时它也能特异性识别并切割Ile-Glu-Gly-Arg序列。FXa在血栓部位特异性的集聚并有强大的活性，而在其它部位浓度很低且几无活性。因为FXa特异质切割Ile-Glu-Gly-Arg序列的特点，可让药物在血栓部分定点释放。

绿色荧光蛋白(GFP)是一种来源于发光水母生物的发光蛋白，由238个氨基酸组成，分子量为27kb，由11个β-折叠围绕着一个α-螺旋而围成圆桶状结构，α-螺旋包含着由3个氨基酸(Ser65、Tyr66、Gly67)经过环化而成的发光基团，在钙离子和紫外光激发下会产生绿色荧光，可以用倒置荧光显微镜下观察到。GFP发出的荧光较稳定，抗光漂白能力强，在pH7-12范围内都能正常发光。GFP可以在不同种属原核、真核细胞中表达，无需复杂的翻译后加工过程就会自动折叠催化并开始发光，既可以作为荧光标记物监测活体细胞中的基因表达，也可以作为体外实验中有用的工具。GFP是基因递送靶向载体的理想报告基因，将GFP编码基因连着目的基因上，根据荧光强度，在体外能评价基因递送载体的细胞转染效率，在体内则能跟踪目的蛋白的转运、分布和靶向性研究。