[发明专利]一种基于噬菌体展示技术定位的加工破坏的Gly m Bd 60K蛋白抗原区域及筛选方法

权利要求书

1.一种基于噬菌体展示技术定位加工破坏Gly m Bd 60K蛋白的抗原区域的氨基酸序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）用天然的β-伴大豆球蛋白饲喂新西兰大白兔，制备β-伴大豆球蛋白多克隆抗体；将过量的经过超高静压处理的β-伴大豆球蛋白加入到制备的β-伴大豆球蛋白多克隆抗体中，37℃温育1h，离心去沉淀，收集上清液，-20℃保存，制得超高静压处理破坏的过敏原表位特异性抗体；

（2）根据蛋白质三级结构及B细胞构象表位预测位置，将Gly m Bd 60K氨基酸序列分为4段，氨基酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4所示，设计Gly m Bd 60K重叠蛋白；

（3）以噬菌体展示技术研究加工破坏Gly m Bd 60K蛋白的抗原区域，在噬菌体表面呈现Gly m Bd 60K及其重叠蛋白；

（4）利用间接竞争ELISA法，进行超高静压破坏过敏原表位的筛选：将表达Gly m Bd60K 重叠片段的所有重组噬菌体和无插入的阴性对照包被于96孔酶标板中，37℃温育1h；经洗涤、封闭，再洗涤后，于37℃将超高静压处理破坏的过敏原表位特异性抗体加入包被重组噬菌体的酶标板中，同时设阴性和空白对照，其中阴性对照一抗为阴性血清，空白对照为无插入阴性噬菌体裂解纯化的蛋白，孵育2 h；再经洗涤后分别加羊抗兔酶标二抗，37℃孵育1 h；经洗涤后并加入TMB单组分显色液，37℃避光显色，然后加入2M的H₂SO₄终止反应，酶标仪读A_450nm值；同时测定加入未加工处理破坏的过敏原表位特异性抗体的OD值；

利用间接竞争ELISA法，精确定位被超高静压破坏的Gly m Bd 60K抗原区域：对所筛选到的所有阳性噬菌体克隆片段进行进一步的重叠分段，每段序列的长度约为100个氨基酸，每一序列与前一序列重叠约30个氨基酸残基，各个片段经PCR扩增后与T7噬菌体载体相连；然后在T7噬菌体表面表达，测定其与被超静高压破坏过敏原表位特异性抗体的结合特性，开展第二轮的筛选与鉴定，经过2-3轮的分段表达和筛选，对被破坏Gly m Bd 60K抗原区域进行精确定位；最后得到精确定位的加工处理破坏最显著的片段的氨基酸序列为SEQ IDNO.16。