[发明专利]一种基于噬菌体展示技术定位的加工破坏的Gly m Bd 60K蛋白抗原区域及筛选方法

说明书

本发明公开了一种基于噬菌体展示技术定位的加工破坏的Gly m Bd 60K蛋白抗原区域及筛选方法，所述抗原区域的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。本发明利用一系列生物信息学软件并参照PDB数据库已解析的β‑伴大豆球蛋白三维晶体结构，以噬菌体展示技术研究加工破坏Gly m Bd 60K蛋白的抗原区域，通过在噬菌体表面呈现Gly m Bd 60K及其overlapping蛋白，对不同加工方法导致Gly m Bd 60K蛋白抗原性降低的区域进行精确定位。为食品工业提供加工方法筛选的理论依据，也可以进一步发展出快速检测加工食品脱敏效果的应用产品。

技术领域

本发明涉及分子生物学、免疫学、生物信息学领域，特别是涉及一种基于噬菌体展示技术定位的加工破坏Gly m Bd 60K蛋白的抗原区域。

背景技术

大豆原产于中国，迄今为止已有近七千年的种植历史。大豆中蛋白含量为35％-38％，且富含不饱和脂肪酸、维生素、矿物质和其他营养成分，具有极高的营养价值，是优质蛋白的重要来源，已广泛应用于食品加工中。但是有少部分人却因对大豆及其制品过敏不能从中获益，通常的症状为起疹子、皮肤发痒、腹泻等。同时有调查显示，随着豆制品消费量的增加，大豆过敏的发病率不断上升。另外，大豆过敏原蛋白也能引起仔猪和妊娠母猪、犊牛、小鼠、养殖鱼类等多种动物的过敏反应，导致动物小肠绒毛萎缩、隐窝增生，肠内组胺释放量增加等过敏性损伤，进而导致消化吸收障碍和过敏性腹泻等病理现象的发生，因此限制了大豆及其制品在食品和饲料中的应用。

已有研究证明，大豆的致敏性，主要是由β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白、Gly m Bd30K(P34)和Gly m Bd 28K引起的。大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白也是大豆中的主要蛋白。β-伴大豆球蛋白是由α’(58～83kDa)、α(58～77kDa)和β(42～53kDa)三种亚基组成的三聚体复合物，其含量分别为45％、35％和20％。β-伴大豆球蛋白的三个亚基均存在过敏原性，目前的研究资料证明Gly m Bd 60K即β-伴大豆球蛋白的α亚基是易感人群的重要过敏原，也是最早被公认的主要过敏原蛋白，能被25％的大豆过敏患者的血清所识别。Gly m Bd 60K的mRNA全长为1955nt，带有poly(A)尾巴，编码605个氨基酸，在N-端含有一个22个氨基酸的信号肽，去除信号肽后的前体肽为583个氨基酸，最后在加工过程中又从N-端剪掉40个氨基酸，形成543个氨基酸的成熟α亚基。

表位(epitope)又称抗原决定簇，是决定抗原特异性的特殊化学基团，也是过敏反应的物质基础。表位通常位于分子表面，大小相当于抗体的结合部位，一般由5-7个氨基酸、单糖或核苷酸组成。根据表位的结构特点分为连续性表位(线性表位)和非连续性表位(构象性表位)；按结合受体细胞不同，分为B细胞表位和T细胞表位。表位类型的不同是造成食物过敏复杂性的关键因素之一。表位定位技术是过敏原表位研究的工具，包括表位定位和表位预测两种。表位预测是运用生物信息学方法对过敏原表位进行预测。传统的表位定位技术如酶解技术、肽扫描技术存在特异性差、费时和昂贵等缺点，而新的过敏原表位定位技术从噬菌体展示技术诞生开始有了新进展。噬菌体展示技术(Phage display technology,PDT)是一种能够将所需性质的多肽从含有大量变异体的集落中提取出来的体外筛选技术。噬菌体展示系统(phage display system)主要分为丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统和T7噬菌体展示系统。跟前面几种展示系统相比，T7噬菌体展示系统最大的优点为它能以高拷贝量展示含50个氨基酸残基的多肽片段和以低拷贝量或以中拷贝量展示含1200个氨基酸残基的外源多肽或蛋白质。此外，它还具有生长迅速、性质稳定、无辅助噬菌体进行包装等特殊性质。目前对大豆过敏原Gly m Bd 60K蛋白的研究主要集中在Gly m Bd 60K蛋白致敏性鉴定、线性表位预测及定位、检测分析、脱敏技术研究等，而应用噬菌体展示技术对大豆过敏原Gly m Bd 60K蛋白表位定位的研究还未见报道，特别是定位经加工处理后破坏的过敏原表位更未见相关文献。

发明内容