[发明专利]一种基于PCR的循环肿瘤细胞的计数方法

说明书

本发明公开了一个基于聚合酶链式反应的计数血液或淋巴液样品中的循环肿瘤细胞的方法。本发明使用的细胞样品可以是经过循环肿瘤细胞富集或是不经过富集的。本发明首先将细胞样品分成许多组分，使得每个组分实际上含有不超过一个循环肿瘤细胞，从每个组分的细胞中提取RNA和DNA，并使用逆转录酶将RNA转录物逆转录为cDNA，然后用PCR方法检测每个组分中的肿瘤特异性序列的存在，并以含有肿瘤特异性序列的组分数量作为样品中循环肿瘤细胞的数量。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年3月5日提交的美国临时专利申请第62/467,181号和于2018年2月25日提交的美国专利申请15/904,393号的权益，所述美国专利申请的内容以参考的方式并入本文中。

技术领域

本发明涉及分子肿瘤学领域的方法和技术，尤其涉及使用高灵敏聚合酶链式反应来检测和计数血液和淋巴样品中的循环肿瘤细胞的方法。

背景技术

循环肿瘤细胞是从原发性和转移性肿瘤组织流入血液中的肿瘤细胞。与侵袭性肿瘤组织活检相比，循环肿瘤细胞可以作为非侵入性、易于获得的“实时液体活检”，并且可用于实时监测肿瘤进展，因此，循环肿瘤细胞的分离和分析对于侵袭性癌症的早期检测，癌症治疗的预后预测，耐药性的检测以及晚期癌症的管理都具有很好的前景。尽管循环肿瘤细胞分析在临床应用中具有很大的潜力，但血液样品中循环肿瘤细胞的稀有度(例如每毫升只有1-10个)和循环肿瘤细胞群体的异质性对于循环肿瘤细胞的检测和分析构成了巨大的技术挑战。

1ml血液样品中只有1-10个循环肿瘤细胞，却含有约8×10⁹个红细胞和5×10⁶个白细胞，因此，在血液中寻找循环肿瘤细胞就像大海捞针一样困难，更糟糕的是，循环肿瘤细胞的异质性使得很难找到通用的遗传学或细胞学标记用来富集和检测循环肿瘤细胞。用于富集循环肿瘤细胞的最常用标记是叫做上皮细胞粘附分子(EpCam)的一种细胞表面蛋白，它在上皮来源的循环肿瘤细胞中表达，使用基于EpCam的免疫磁珠方法来富集循环肿瘤细胞将导致不表达或低水平表达EpCam的循环肿瘤细胞的丢失，为了避免这个问题，人们使用针对不同肿瘤特异性抗原的多种抗体来选择循环肿瘤细胞。另一种选择循环肿瘤细胞的方法是基于不同细胞类型之间的大小差异，因为肿瘤细胞通常比白细胞和红细胞的尺寸更大，然而，由于不同类型的肿瘤细胞的大小不同，小的肿瘤细胞可能与白血细胞差不多大小，因此，这种基于细胞大小差异的分离方法会导致小肿瘤细胞的丢失。浓缩过程中循环肿瘤细胞的丢失是造成循环肿瘤细胞检测和计数不准确的一个重要因素。

目前的循环肿瘤细胞检测方法可以分为两种主要类型：基于核酸的方法和基于细胞计数的方法。基于核酸的检测方法使用聚合酶链式反应(PCR)来检测肿瘤细胞中特异性表达的DNA或RNA序列。通过使用多种肿瘤特异性标记物，这种基于PCR的方法可以有很高的灵敏度，它可以在不富集循环肿瘤细胞的情况下进行，但相应会降低灵敏度。该方法检测从裂解细胞制备的核酸，因此不能观察细胞形状及进行细胞计数。这类方法的另一个缺点是很难使不同实验室的技术标准化，因此很难在临床环境中可靠地使用。基于细胞计数的检测方法使用免疫组织化学和免疫荧光来显现细胞形状并计数循环肿瘤细胞。这类方法首先对来自血液样品的细胞进行预处理以富集肿瘤细胞，然后通过用抗体染色使富集的细胞可视化，染色抗体一般包括针对多种肿瘤特异性标记物的抗体和一种针对白细胞特异性标记物的抗体，肿瘤细胞具有至少一种肿瘤特异性标记物显示阳性同时白细胞特异性标志物显示为阴性，这种方法在检测循环肿瘤细胞时具有很高的特异性。但是，这种方法取决于肿瘤细胞中肿瘤特异性标记物的表达水平和所用抗体的特异性，由于没有标记物对肿瘤细胞是纯粹特异的，并且标记物表达水平在不同的肿瘤细胞中有所不同，所以可能导致假阳性和假阴性检测的结果。该方法的灵敏度很大程度上取决于抗体对肿瘤特异性标记物的特异性和结合强度，与基于核酸的方法相比较，这种方法通常有更高的特异性，但更低的灵敏度。