[发明专利]一种肺炎克雷伯菌的扩增引物组、应用及肺炎克雷伯菌的检测方法

权利要求书

1.一种肺炎克雷伯菌的扩增引物组，其特征在于：包括：如SEQ ID NO：1所示的交叉内引物CP1，如SEQ ID NO：2所示的交叉内引物CP2，如SEQ ID NO：3所示的置换引物F1，如SEQID NO：4所示的置换引物F2以及如SEQ ID NO：5-10所示的扩增引物D1、C1、R1、D2、C2和R2；所述扩增引物C1或C2的5’端标记生物素，得到C1*或C2*；所述扩增引物D1或D2的5’端标记半抗原，得到D1*或D2*。

2.根据权利要求1所述肺炎克雷伯菌的扩增引物组，其特征在于：所述半抗原为异硫氰酸荧光素。

3.根据权利要求1所述肺炎克雷伯菌的扩增引物组，其特征在于：所述交叉内引物CP1包含C1区域的互补序列Cls和P1，为5′-Cls-P1；所述交叉内引物CP2包含C2区域的互补序列C2s和P2，为5′-C2s-P2。

4.如权利要求1-3任一项所述肺炎克雷伯菌的扩增引物组，其特征在于：所述扩增引物组用于多交叉恒温扩增肺炎克雷伯菌的特征基因rcsA。

5.一种检测肺炎克雷伯菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)提取待检测肺炎克雷伯菌样品基因组；

2)提供所述肺炎克雷伯菌的扩增引物组：CP1、CP2、F1、F2、D1、C1、R1、D2、C2、R2、C1*、C2*以及D1*、D2*；

3)在包括所述扩增引物组的多交叉恒温扩增反应体系下，使用待检测肺炎克雷伯菌样品的基因组核酸作为模板恒温扩增，得到扩增产物；

4)使用金纳米生物传感器检测步骤3)的扩增产物。

6.根据权利要求5所述检测肺炎克雷伯菌的方法，其特征在于：所述步骤3)恒温扩增是在60-69℃的环境中进行的。

7.根据权利要求5所述检测肺炎克雷伯菌的方法，其特征在于：所述引物CP1的浓度为30pmol，引物CP2的浓度为60pmol，引物F1和F2的浓度为10pmol，引物R1，R2，D1和D2的浓度为30pmol，引物C1和C2的浓度为20pmol。

8.根据权利要求5所述检测肺炎克雷伯菌的方法，其特征在于：所述多交叉恒温扩增反应体系还包括10mM的甜菜碱，6mM的MgSO₄，1mM的dNTP，12.5μL的10×Bst DNA聚合酶缓冲液，10U的链置换DNA聚合酶，1μL的模板，补加去离子水至25μl。

9.根据权利要求6所述检测肺炎克雷伯菌的方法，其特征在于：所述多交叉恒温扩增反应体系的反应恒温在65℃下30min，85℃下5min终止反应。

10.根据权利要求5所述检测肺炎克雷伯菌的方法，其特征在于：所述金纳米生物传感器包含样品垫，金标垫，纤维膜，吸水垫及背板；所述样品垫，金标垫，纤维膜及吸水垫依次组装在背板上，所述纤维膜上设置有检测线及控制线；将金纳米粒子偶联的链霉素亲和素，抗异硫氰酸荧光素抗体及生物素偶联的牛血清蛋白分别包被在金标垫，检测线及控制线上。