[发明专利]一种肺炎克雷伯菌的扩增引物组、应用及肺炎克雷伯菌的检测方法

说明书

本发明提供了一种肺炎克雷伯菌的扩增引物组、应用及肺炎克雷伯菌的检测方法，检测肺炎克雷伯菌的方法，包括以下步骤：1)提取待检测肺炎克雷伯菌样品的基因组；2)提供所述肺炎克雷伯菌的特异基因rcsA扩增引物组：CP1、CP2、F1、F2、D1、C1、R1、D2、C2、R2、C1*、C2*以及D1*、D2*；3)在包括所述扩增引物组的多交叉恒温扩增反应体系下，使用待检测肺炎克雷伯菌样品的基因组核酸作为模板进行恒温扩增，得到扩增产物；4)使用金纳米生物传感器检测步骤3)的扩增产物。本发明方法以多交叉恒温扩增为基础，结合纳米生物检测技术，能够快捷，敏感，高特异性的鉴定肺炎克雷伯菌。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种肺炎克雷伯菌的扩增引物组、应用及肺炎克雷伯菌的检测方法。

背景技术

肺炎克雷伯菌(Klebsiela Pneumoniae，K.P)，俗称肺炎杆菌，为临床分离及医院感染的重要致病菌之一，是肠杆菌科克雷伯氏菌属中最为重要的一类菌，其所致疾病占克雷伯氏菌属感染的95％以上。肺炎克雷伯菌为革兰阴性杆菌，存在于人体上呼吸道和肠道，当机体抵抗力降低时，便经呼吸道进入肺内而引起大叶或小叶融合性实变，病变中渗出液粘稠而重，致使叶间隙下坠。在院内感染的败血症中，克雷伯杆菌以及绿脓杆菌和沙雷氏菌等均为重要病原菌，病死率较高。快速诊断病原菌是有效治疗这类疾病的基石，但目前临床上对于肺炎克雷伯菌分离鉴定主要依赖于传统的细菌培养和生化鉴定，该方法包括二次增菌，选择培养及后续的生化鉴定，耗时至少3天，虽然生化鉴定的结果可以依靠全自动微生物鉴定仪判读，但该方法的劣势耗时耗力依然存在，严重地拖延临床的诊断及治疗时间。随着核酸诊断技术的快速发展，一些以PCR为基础的诊断技术(如普通PCR技术，荧光PCR技术)被用于肺炎克雷伯菌的快速诊断，然而这些方法依赖于昂贵复杂的仪器设备及高成本的探针合成，且需要后续的电泳步骤及熟练的操作人员。一些基层实验室无法满足上述条件，因此限制了这些技术在基层的应用。此外，目前运用PCR方法和real-time PCR方法检测肺炎克雷伯菌的技术，检测过程也要耗时2-4小时，也不利于快速检测和应急检测。因此，为了给予临床病人准确快速的诊断，找出特异的抗菌治疗方法，研发一个省时、省力和特异性较高的，能快捷，敏感，特异的鉴定肺炎克雷伯菌的检测方法成为必要。

发明内容

针对现有技术中的上述缺陷，本发明的主要目的在于提供一种肺炎克雷伯菌的扩增引物组、应用及肺炎克雷伯菌的检测方法，所述方法以多交叉恒温扩增(MCDA)为基础，结合纳米生物检测技术，能够快捷，敏感，高特异性的鉴定肺炎克雷伯菌。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种肺炎克雷伯菌的扩增引物组，包括：如SEQ ID NO：1所示的交叉内引物CP1，如SEQ ID NO：2所示的交叉内引物CP2，如SEQID NO：3所示的置换引物F1，如SEQ ID NO：4所示的置换引物F2以及如SEQ ID NO：5-10所示的扩增引物D1、C1、R1、D2、C2和R2；所述扩增引物C1或C2的5’端标记生物素，得到C1*或C2*；所述扩增引物D1或D2的5’端标记半抗原，得到D1*或D2*。

作为进一步的优选，所述半抗原为异硫氰酸荧光素(FITC)。

作为进一步的优选，引物CP1包含C1区域的互补序列(Cls)和P1，为5′-Cls-P1；引物CP2包含C2区域的互补序列(C2s)和P2，为5′-C2s-P2。

所述扩增引物组用于多交叉恒温扩增肺炎克雷伯菌的rcsA基因。

一种检测肺炎克雷伯菌的方法，包括以下步骤：

1)提取待检测肺炎克雷伯菌样品的基因组；

2)提供所述肺炎克雷伯菌的扩增引物组：CP1、CP2、F1、F2、D1、C1、R1、D2、C2、R2、C1*、C2*以及D1*、D2*；