[发明专利]一种橙皮苷的制备方法在审
| 申请号： | 201810171714.7 | 申请日： | 2018-03-01 |
| 公开（公告）号： | CN108504680A | 公开（公告）日： | 2018-09-07 |
| 发明（设计）人： | 李文云;徐娟;陈嘉景;袁子彧;彭昭欣;石梅艳;何珍玉;田静 | 申请（专利权）人： | 华中农业大学;贵州省果树科学研究所 |
| 主分类号： | C12N15/82 | 分类号： | C12N15/82;C12N15/70;C12N15/65;C12N15/54;C12P19/60 |
| 代理公司： | 北京轻创知识产权代理有限公司 11212 | 代理人： | 杨立;李航 |
| 地址： | 430070 湖*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 橙皮苷 表达载体 愈伤组织 橙皮素 底物 构建 制备 农杆菌介导 转移酶基因 分离纯化 工程细胞 鼠李糖基 悬浮培养 悬浮细胞 遗传转化 干燥物 混匀 甲醇 能耗 合成 转入 | ||
1.一种橙皮苷的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)构建1,6-鼠李糖基转移酶基因的表达载体；(2)将步骤(1)中所构建的表达载体利用农杆菌介导的遗传转化方法转入到愈伤组织中；(3)向步骤(2)所得的愈伤组织中加入橙皮素底物进行悬浮培养；(4)收集步骤(3)中所得悬浮细胞进行冷冻干燥后，并将所得干燥物溶于80％甲醇中混匀并进行离心，得到橙皮苷。
2.根据权利要求1所述的橙皮苷的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中愈伤组织的为烟草愈伤组织。
3.根据权利要求1所述的橙皮苷的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中1,6-鼠李糖基转移酶基因构建方法包括如下步骤：
s1:设计并制备1,6-鼠李糖基转移酶基因特异引物:
1,6-RhaT-F为SEQ ID NO.1,
1,6-RhaT-R为SEQ ID NO.2；
s2:采用PCR方法从甜橙、宽皮柑橘或柠檬果实的cDNA中扩增得到1,6-鼠李糖基转移酶基因的序列全长；
s3:回收1,6-鼠李糖基转移酶基因的序列后并与工程菌的质粒DNA连接；
s4:将上述工程菌转化到感受态大肠杆菌菌株中；
s5:筛选阳性的大肠杆菌菌株进行增殖并提取质粒；
s6:将步骤s5中获得的质粒利用GateWay试剂盒构建转化载体，并测序，选择阳性菌液提取质粒，所得质粒即为1,6-鼠李糖基转移酶基因的表达载体。
4.根据权利要求3所述的橙皮苷的制备方法，其特征在于，所述转化载体为带有潮霉素抗性标记的PHTWG2D。
5.根据权利要求3所述的橙皮苷的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌菌株为大肠杆菌Trans 5α菌株。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的橙皮苷的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中冷冻干燥时间为3d；离心时以4000g的离心力离心10min。
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