[发明专利]一种橙皮苷的制备方法

说明书

本发明公开了一种橙皮苷的制备方法，包括如下步骤：(1)构建1,6‑鼠李糖基转移酶基因的表达载体；(2)将步骤(1)中所构建的表达载体利用农杆菌介导的遗传转化方法转入到愈伤组织中；(3)向步骤(2)所得的愈伤组织中加入橙皮素底物进行悬浮培养；(4)收集步骤(3)中所得悬浮细胞进行冷冻干燥后，并将所得干燥物溶于80％甲醇中混匀并进行离心，得到橙皮苷。本发明采用上述方法，利用工程细胞以橙皮素作为底物不断的合成橙皮苷，其效率高，且分离纯化简单，同时能耗低，产物的纯度高。

技术领域

本发明涉及一种橙皮苷的制备方法，尤其涉及一种利用工程细胞来合成橙皮苷的方法。

背景技术

橙皮苷是柑橘中一种主要的黄烷酮之一，是甜橙、宽皮柑橘、柠檬等非苦味柑橘果实中含量最丰富的一种黄烷酮糖苷，而在有苦味的柚果实中却检测不到(Rousef et al,1987；Gattuso et al.,2007；Frydman et al.,2013；Chen et al.,2015)。除了对果实风味的影响外，橙皮苷在抵御病虫侵害方面也具有重要作用(Del Rio et al.,2004)。橙皮苷不仅对柑橘风味有重要影响，还具有广泛的药用价值，如在抗氧化、抗癌、抑菌、消炎、预防心脑血管等方面具有显著作用。临床常作为维生素类药(Roohbakhsh et al,2014)，橙皮苷经苯丙烷代谢途径合成，是橙皮素两步糖基化后的鼠李糖苷。1,6-鼠李糖基转移酶(1,6-RhaT)是第2步糖基化过程中的关键酶(Frydman et al,2013)。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的在于：在于提供一种利用工程细胞制备高纯度橙皮苷的方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：一种橙皮苷的制备方法，包括如下步骤：(1)构建1,6-鼠李糖基转移酶基因的表达载体；(2)将步骤(1)中所构建的表达载体利用农杆菌介导的遗传转化方法转入到愈伤组织中；(3)向步骤(2)所得的愈伤组织中加入橙皮素底物进行悬浮培养；(4)将步骤(3)中所得悬浮细胞进行冷冻干燥后，并将所得干燥物溶于80％甲醇中混匀并进行离心，得到橙皮苷。

上述技术方案的有益效果在于：采用上述方法，利用工程细胞利用橙皮素作为底物不断的合成橙皮苷，其效率高，且分离纯化简单，同时能耗低，产物的纯度高。

上述技术方案中所述步骤(2)中愈伤组织的为烟草愈伤组织。

上述技术方案的有益效果在于：采用烟草愈伤组织作为感染载体，其感染效率高，培养方便。

上述技术方案中所述步骤(1)中1,6-鼠李糖基转移酶基因构建方法包括如下步骤：

s1:设计并制备1,6-鼠李糖基转移酶基因特异引物:

1,6-RhaT-F为SEQ ID NO.1,

1,6-RhaT-R为SEQ ID NO.2；

s2:采用PCR方法从甜橙、宽皮柑橘或柠檬果实的cDNA中扩增得到1,6-鼠李糖基转移酶基因的序列全长；

s3:回收1,6-鼠李糖基转移酶基因的序列后并与工程菌的质粒DNA连接；

s4:将上述工程菌转化到感受态大肠杆菌菌株中；

s5:筛选阳性的大肠杆菌菌株进行增殖并提取质粒；

s6:将步骤s5中获得的质粒利用GateWay试剂盒构建转化载体，并测序，选择阳性菌液提取质粒，所得质粒即为1,6-鼠李糖基转移酶基因的表达载体。

上述技术方案的有益效果在于：其方便简单。

上述技术方案中所述转化载体为带有潮霉素抗性标记的PHTWG2D。

上述技术方案的有益效果在于：便于检测。