[发明专利]基于双分子荧光互补的新型细胞微丝骨架标记方法

说明书

细胞骨架蛋白在细胞的生命活动中起到非常重要的支撑作用，是细胞运动和分裂的基础。对于微丝骨架的标记和长时间观察可以获得细胞微丝骨架的亚细胞分布和动态行为，帮助我们理解微丝骨架的结构和功能。现存的各种标记方法无法同时实现活细胞、高分辨、长时程、无侵入、高特异、高稳定等特点，限制了其在活细胞微丝骨架标记和追踪中的应用。本发明使用一种基于双分子荧光互补的新型细胞微丝骨架标记方法，利用微丝骨架结合短肽LifeAct融合分裂的蛋白，在该融合蛋白不结合纤维状微丝骨架时不发荧光，在其结合时发光，实现活细胞内无荧光背景的微丝蛋白的标记和成像。新的微丝骨架的标记方法在正常以及病理和药理条件下哺乳动物细胞中有着广泛的应用。

技术领域

本发明涉及一种新的细胞内微丝骨架F-actin的探针开发和标记方法，及其在细胞生物学和细胞力学中的应用。属于细胞生物学领域。

背景技术

哺乳细胞中含有大量的细胞骨架蛋白用以支撑细胞的刚性结构。细胞各种生命活动的进行离不开细胞骨架的支持作用。细胞骨架是由丰富的蛋白纤维网络结构构成，贯穿细胞的每一个角落，不仅在维持细胞形态，承受外力、保持细胞内部结构的有序性方面起重要作用，而且还参与许多重要的生命活动。如:在细胞分裂中细胞骨架牵引姐妹染色单体的分离，在细胞物质运输中，各类囊泡和细胞器可沿着细胞骨架定向转运，细胞外基质刺激细胞的信号传递。在肌肉细胞中，细胞骨架和它的结合蛋白组成动力系统。在白细胞的迁移、精子的游动、神经细胞轴突和树突的伸展等方面都与细胞骨架有关。另外，在植物细胞中细胞骨架还可以指导细胞壁的合成。细胞骨架主要包括微管，微丝和中间纤维，广义的细胞骨架还包括核基质、核纤层和细胞外基质，形成贯穿于细胞核、细胞质、细胞外的一体化网络结构。细胞在病理情况下常常会出现细胞骨架系统异常。微管减少、解聚、细胞骨架异常等可增强癌细胞的运动能力，会导致肿瘤的恶性转移和转化。在脑神经元中有大量扭曲变形的微管和大量受损的中间纤维，则会导致阿尔茨海默症。微丝束及其末端黏着斑的破坏以及肌动蛋白小体的形成，常常伴随肿瘤细胞的浸润和转移。此外，中间纤维的分布具有严格的组织特异性，绝大多数肿瘤细胞在发生转移后仍表现其原发肿瘤的中间纤维类型，可用来辅助判断肿瘤类型。

微丝是细胞骨架的一种，普遍存在于所有真核细胞中，是一个实心状的纤维，直径为4nm-7nm。一般细胞中含量约占细胞内总蛋白质的1％-2％，但在活动较强的细胞中可占20％-30％。微丝具有多种功能，在不同细胞中表现不同，在肌细胞组成粗肌丝、细肌丝，可以收缩，在非肌细胞中主要起支撑作用、非肌性运动和信息传导作用。微丝主要由肌动蛋白(actin)构成，和分子马达蛋白肌球蛋白(myosin)一起作用，使细胞运动。它们参与细胞的变形虫运动、植物细胞的细胞质流动与肌肉细胞的收缩等细胞生物学过程。

虽然细胞骨架是刚性的结构，但是并不表示细胞骨架是一成不变的。相反，细胞骨架同时是一个高度动态的结构，在细胞生命活动中，细胞骨架必须不断的重塑，聚合，解聚才能正常的发挥功能。细胞内的微丝蛋白主要以两种形式存在，单体化(G-actin)和聚合化(F-actin)。这两种形式的比例在时间和空间上被一系列信号转导蛋白高度调控，以适应细胞在不同条件下的生命活动的需要。所以发展活细胞细胞微丝骨架的标记技术和方法对理解细胞骨架的结构和功能的关系非常重要。