[发明专利]一种高活性碳酸酐酶及构建方法和应用

权利要求书

1.一种高活性碳酸酐酶，其特征在于，将Bacillus Clausii的碳酸酐酶的29位天冬氨酸、233位甘氨酸和83位天冬氨酸中的一个或一个以上进行突变。

2.根据权利要求1所述的高活性碳酸酐酶，其特征在于，所述29位天冬氨酸由谷氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸或苏氨酸中的一种取代。

3.根据权利要求1所述的高活性碳酸酐酶，其特征在于，所述233位甘氨酸由组氨酸、丝氨酸、色氨酸、赖氨酸或精氨酸中的一种取代。

4.根据权利要求1所述的高活性碳酸酐酶，其特征在于，所述83位天冬氨酸由谷氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸或苏氨酸中的一种取代。

5.根据权利要求1～4任一项所述的高活性碳酸酐酶的应用，其特征在于，所述的碳酸酐酶应用于CO₂的水合可逆反应。

6.根据权利要求1～4任一项所述的高活性碳酸酐酶的构建方法，其特征在于，步骤如下：

步骤1：将Bacillus Clausii的碳酸酐酶进行突变；

步骤2：获得目的基因；

步骤3：获得含有目的基因的大肠杆菌BL21；

步骤4：扩大培养所述转化的大肠杆菌BL21，加入IPTG诱导表达，收集所述大肠杆菌BL21并裂解，获取裂解液和沉淀，利用SDS-PAGE和Western blot的方法对融合蛋白进行鉴定；

步骤5：使用镍柱分离表达所述融合蛋白，凝胶过滤纯化，用盐酸胍对所述融合蛋白进行复性；

步骤6：检测碳酸酐酶的酶活。

7.根据权利要求6所述的高活性碳酸酐酶的构建方法，其特征在于，在所述步骤1中，对所述Bacillus Clausii的碳酸酐酶的29位天冬氨酸、233位的甘氨酸和83位天冬氨酸中的一个或一个以上进行突变。

8.根据权利要求6所述的高活性碳酸酐酶的构建方法，其特征在于，在所述步骤2中，根据目的基因设计引物后，从所述Bacillus Clausii细胞中提取RNA，反转录得到cDNA，再利用所述引物进行PCR和琼脂糖凝胶电泳，扩增分离得到目的基因。

9.根据权利要求6所述的高活性碳酸酐酶的构建方法，其特征在于，在所述步骤3中，将所述目的基因连接至克隆载体上，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒并转化至大肠杆菌BL21中，并鉴定含有目的基因的大肠杆菌BL21。

10.根据权利要求6所述的高活性碳酸酐酶的构建方法，其特征在于，在所述步骤5中，所述盐酸胍的浓度为0.3mol/L～0.6mol/L。