[发明专利]一种高活性碳酸酐酶及构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种高活性碳酸酐酶及构建方法和应用，用于提升热稳型碳酸酐酶的CO₂催化转化活性。本发明将Bacillus Clausii的碳酸酐酶的29位天冬氨酸、233位甘氨酸或83位天冬氨酸进行突变，突变位点为一个或一个以上。操作步骤为：首先对碳酸酐酶结构的性质进行分析，在此基础上对残基进行突变，构建含有目的基因的载体，然后对蛋白进行表达，分离纯化和复性，最后对酶活进行测定。本发明可有效提高在高温条件下CO₂捕集转化效率。

技术领域

本发明属于生物化学领域，主要涉及一种高活性碳酸酐酶及构建方法和应用。

背景技术

碳酸酐酶(CA)是含Zn²⁺的金属酶，它是一类可将CO₂催化转化为HCO^3-的水合酶催化剂。通常在没有催化剂条件下CO₂的水合可逆反应的反应速率非常缓慢，碳酸酐酶可将反应速率从15秒提升到每秒10⁶个反应。正是由于CA具备高效专一、环境友好等特点，近年来利用碳酸酐酶的CO₂捕集技术受到越来越多的重视。根据氨基酸序列的不同，碳酸酐酶至少有α，β，γ，δ，ε和ζ等六种不同类型,不同种属CA酶的催化活性存在极大差异。

碳酸酐酶的引入可以大幅降低化学吸附解析过程的能源消耗，但过程中的高温工作环境、体系内重金属离子的存在都对CA的稳定性和活性产生极大影响，严重制约其应用。为此人们从嗜热古细菌种中筛选出三种热稳定型CA，分别为来自Methanosarcinathermophila的CAM，来自Methanobacterium thermoautotrophicum的CAB和来自Pyrococcus horikoshii的CAP。与人源CAII的失活温度50℃相比，CAM和CAB的失活温度有显著提高，分别为75℃和90℃。Novozymes从Bacillus Clausii获得了热稳定性高的碳酸酐酶，在80℃停留15分钟后残留酶活为17％。这些热稳定CA与天然人源CAII相比，尽管热稳定性能有所提升，但却牺牲了催化反应能力，催化反应常数降低了一至几个数量级。

为此，本专利提出以氨基酸作基本单元对高温酶进行突变，构建高活性的高温碳酸酐酶。

发明内容

为了提高CO2的水合可逆反应的反应速率，本发明公开一种高活性碳酸酐酶及构建方法和应用。

本发明公开一种高活性碳酸酐酶，一种高活性碳酸酐酶，其特征在于，将BacillusClausii的碳酸酐酶的29位天冬氨酸、233位甘氨酸和83位天冬氨酸中的一个或一个以上进行突变。

作为改进的技术方案，所述29位天冬氨酸由谷氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸或苏氨酸中的一种取代。

作为改进的技术方案，所述233位甘氨酸由组氨酸、丝氨酸、色氨酸、赖氨酸或精氨酸中的一种取代。

作为改进的技术方案，所述83位天冬氨酸由谷氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸或苏氨酸中的一种取代。

作为改进的技术方案，所述的碳酸酐酶应用于CO₂的水合可逆反应。

本发明还提供上述高活性碳酸酐酶的构建方法，步骤如下：

步骤1：将Bacillus Clausii的碳酸酐酶进行突变；

步骤2：获得目的基因；

步骤3：获得含有目的基因的大肠杆菌BL21；

步骤4：扩大培养所述转化的大肠杆菌BL21，加入IPTG诱导表达，收集所述大肠杆菌BL21并裂解，获取裂解液和沉淀，利用SDS-PAGE和Western blot的方法对融合蛋白进行鉴定；

步骤5：使用镍柱分离表达所述融合蛋白，凝胶过滤纯化，用盐酸胍对所述融合蛋白进行复性；