[发明专利]一种T细胞受体的扩增方法

权利要求书

1.一种T细胞受体的扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1，提取、分离获取人外周血单个核细胞；

S2，将S1中的人外周血单个核细胞置于培养基中，加入抗原多肽和白细胞介素-2；

S3，分选，获取CD8+、IFN-γ双阳性的单细胞；

S4，将S3的双阳性单细胞进行反转录；

S5，以S4的反转录产物作为模板，进行PCR扩增，获得T细胞受体的扩增产物。

2. 如权利要求1所述的T细胞受体的扩增方法，其特征在于，还包括酶切，对T细胞受体的扩增产物进行纯化的步骤。

3.如权利要求1或2所述的T细胞受体的扩增方法，其特征在于，所述S1步骤包括

S10，抽取外周血，转移至离心管中，加入磷酸盐缓冲液进行稀释；

S11，取淋巴细胞分离液，加入稀释后的外周血，离心，洗涤获得淋巴细胞；

S12，采用密度梯度离心的方法分离S11中的淋巴细胞，得到单个核细胞。

4. 如权利要求1或2所述的T细胞受体的扩增方法，其特征在于，所述S2中的抗原多肽为T细胞可识别多肽，S2中的培养基为RPMI 1640培养基。

5.如权利要求1或2所述的T细胞受体的扩增方法，其特征在于，所述S2中的多肽浓度为1μM，白细胞介素-2的浓度为20IU/ml。

6. 如权利要求1或2所述的T细胞受体的扩增方法，其特征在于，所述S5中的PCR扩增技术为nested PCR扩增技术。

7. 如权利要求6所述的T细胞受体的扩增方法，其特征在于，其中扩增TCR α链时第一轮PCR采用的引物序列分别如SEQ ID NO：1-42所示，扩增TCR α链时第二轮PCR采用的引物序列分别如SEQ ID NO：43-83所示。

8. 如权利要求6所述的T细胞受体的扩增方法，其特征在于，其中扩增TCR β链时第一轮PCR采用的引物序列分别如SEQ ID NO：84-111所示，扩增TCR β链时第二轮PCR采用的引物序列分别如SEQ ID NO：112-139所示。

9. 如权利要求6所述的T细胞受体的扩增方法，其特征在于，所述PCR扩增时的反应体系为2XGC Buffer 10μL, dNTP 1.6μL, 引物混合物0.8μL, 重蒸水6.5μL, PrimeStar HSDNA polymerase聚合酶 0.1μL, 反转录产物 1μL。

10. 如权利要求6所述的T细胞受体的扩增方法，其特征在于，所述PCR扩增时的反应条件是：95°C 2min，95°C 20s、52-60°C 20s、72°C 45s，35个循环，最后72°C 7min。