[发明专利]一种T细胞受体的扩增方法

说明书

本发明公开了一种T细胞受体的扩增方法，包括如下步骤：S1，提取、分离获取人外周血单个核细胞；S2，将S1中的人外周血单个核细胞置于培养基中，加入抗原多肽和白细胞介素‑2；S3，分选，获取CD8+、IFN‑γ双阳性的单细胞；S4，将S3的双阳性单细胞进行反转录；S5，以S4的反转录产物作为模板，进行PCR扩增，获得T细胞受体的扩增产物。本发明T细胞受体的扩增方法通过在引物序列两端设计不同的限制性内切酶位点，便于进行酶切过程，起到纯化T细胞受体的作用。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种T细胞受体的扩增方法。

背景技术

T细胞在病毒和肿瘤控制中起着重要作用。T细胞由pMHC（peptide-majorhistocompatibility complex, 多肽-主要组织相容性复合物)和TCR（T cell receptor,T细胞受体）相互作用而激活。pMHC和TCR相互作用后会诱导T细胞的扩增及效应功能的产生，包括细胞因子分泌及细胞毒性活性。T细胞也能穿透感染或转化的组织来产生效应功能，比如肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor infiltrating lymphocytes, TIL）。然而，在一些慢性病毒感染和肿瘤中，响应的效应T细胞会逐渐的衰竭并且变得功能失常。此外，控制肿瘤或感染需要大量高度反应性的淋巴细胞，而在人体正常免疫耐受机制下，这不可能发生。一种能够克服这种障碍的方法是过继性淋巴细胞疗法。

过继性淋巴细胞疗法，比如体外扩增的或TCR改造的抗原特异性T细胞已经在临床上成功应用于病毒及肿瘤的控制。体外扩增病毒或肿瘤特异性T细胞需要大量的时间来制备，且T细胞针对的靶标通常也没有完全明白。表达改造的TCR和CAR（Chimeric AntigenReceptor, 嵌合抗原受体）的淋巴细胞针对特定的抗原。CAR基于抗原-抗体类型的相互作用识别表面抗原，而TCR识别肿瘤相关的pMHC复合物。针对表面抗原的CAR疗法需要通用的（甚至在健康的，非肿瘤组织上也有表达）且不会引起显著毒性的肿瘤相关抗原。TCR针对的肿瘤特异性抗原代表了另外一种选择：能够提供更高的特异性，减少非肿瘤相关毒性。除了临床上的应用，一套扩增及表达TCR的系统还能在研究TCR的结构及功能时成为有价值的工具。

目前，存在一些能够快速确定、扩增抗原特异性TCR的方法，这些方法明显缩短了基于TCR免疫疗法的时间，在免疫研究领域具有重要贡献。但是，这些方法仍然存在局限性。首先，依赖于深度测序和大量分选细胞的克隆方法依然受制于细胞数量。第二，对于大量的分选，TCR链的配对需要算法的介入，这对于表达两条同一类型、不同TCR链（比如两条TCRα链）的细胞在处理时会有困难。第三，这些方法在克隆TCR前需要对分离的细胞进行扩增，可能导致后续分析时TCR谱发生改变和/或效率降低。

DASH，Pradyot等人在WO 2017/096239A1提出使用多种引物进行TCR扩增，但是扩增效率仅为61%左右，扩增效率不高。在实际操作中，扩增后的TCR进行菌落PCR鉴定时，挑选30个菌落都不能得到TCR基因片段，影响后续的应用。

发明内容

为了解决现有的TCR扩增方法扩增效率低的问题，本发明的目的是提供一种T细胞受体的扩增方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种T细胞受体的扩增方法，包括如下步骤：

S1，提取、分离获取人外周血单个核细胞；

S2，将S1中的人外周血单个核细胞置于培养基中，加入抗原多肽和白细胞介素-2；

S3，分选，获取CD8+、IFN-γ双阳性的单细胞；

S4，将S3的双阳性单细胞进行反转录；

S5，以S4的反转录产物作为模板，进行PCR扩增，获得T细胞受体的扩增产物。