[发明专利]检测食品中产气荚膜梭菌和gyrA基因的引物、试剂盒和方法

权利要求书

1.一种检测食品中产气荚膜梭菌及gyrA基因的引物，其特征在于该引物和探针组合的序列分别为:

上游引物recAF:tgggagattctcacgttggtc

下游引物recAR:gcttgcttaaatggaggagca

探针recAP:acaacaccaggtggtagagcgt

上游引物gyrAF:tggtgaggaaaaagaaccagt

下游引物gyrAR:tgtgtcttgcatttttgtgtgt

探针gyrAP:ggaccagatttccctacagcagga。

2.一种检测食品中产气荚膜梭菌及gyrA基因的数字PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒中20.0μL反应体系包括以下组分:其中2×ddPCR Super Mix 10.0μL，上、下游引物各1.0μL、探针各1.0μL，DNA模板4.0μL。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的上游引物recAF与上游引物gyrAF的含量比例为0.1-1:1。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于所述的下游引物recAR与下游引物gyrAR的含量比例为0.1-1:1。

5.一种检测食品中产气荚膜梭菌及gyrA基因的方法，其特征在于包括以下步骤:

A、提取样品DNA；

B、将各反应组分加入如权利要求2所述的20.0μl反应体系，然后加入70.0μl矿物油，混匀后转移到微滴发生器上自动产生微滴；同时分别取所述试剂盒中的阳性质控、和阴性质控，按照与步骤A相同的方法处理，得到相应的DNA模板；

C、将制备数字PCR混合液制作为油包水PCR微反应,并全部转移到96孔反应板PCR反应管中；再将96孔反应板在封膜仪上封膜，并置于普通PCR仪进行PCR反应；

D、打开微滴荧光检测器应用软件，将PCR反应结束后的96孔反应板直接插入设备，检测每PCR反应管中微滴的PCR反应情况,最后根据珀松分布定律算出待测基因的拷贝数。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于步骤C中PCR扩增的反应程序按以下步骤进行:

(1)94℃预变性3min；

(2)94℃变性10s，57.6℃退火1min，共进行40个循环；

(3)98℃酶热失活10min；

(4)4℃停止反应。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于步骤A所述的提取样品DNA:挑取经可疑的单个菌落,加入200μl灭菌重蒸水中,制备产气荚膜梭菌菌悬液,将其置于干式恒温器上100℃加热20min,然后于12000r/min离心10min,取上清液分装Eppendorf管,作为扩增反应的DNA粗制模板，溶解于50μL的TE溶液中。