[发明专利]检测食品中产气荚膜梭菌和gyrA基因的引物、试剂盒和方法

说明书

本发明公开了一种检测食品中产气荚膜梭菌和gyrA基因的引物、试剂盒和方法，该引物的序列和探针序列分别为:上游引物recAF；下游引物recAR；探针recAP；上游引物gyrAF；下游引物gyrAR；探针gyrAP。本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种引物且组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确，适用于双重ddPCR检测食品中产气荚膜梭菌及gyrA的试剂盒；本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测食品中产气荚膜梭菌及gyrA的方法，该方法操作简便、快速，检测结果准确。

技术领域

本发明涉及一种检测食品中产气荚膜梭菌和gyrA基因的引物，本发明还涉及一种包含上述引物用于检测食品中产气荚膜梭菌及gyrA基因的双重微滴式数字PCR(ddPCR)检测试剂盒，本发明还涉及一种采用上述试剂盒检测食品中产气荚膜梭菌及gyrA基因的方法。

背景技术

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是一种属于梭菌属的革兰氏阳性菌，具有荚膜，可产生芽孢，不具有运动性。C.perfringens是引起人畜共患病的主要病原菌之一，该菌的致病因子是其所产生的外毒素。目前，已发现C.perfringens产生的外毒素多17种，并以α型、β型、ε型和ι型4种毒素最为常见；C.perfringens还会产生其他多种毒素或者潜在的致毒因子，如肠毒素(CPE)。根据所产毒素的不同，C.perfringens可分为5种类型。在美国和一些发展中国家，由A型C.perfringens菌引起的食物中毒是最常见报道的食物中毒之一。由C.perfringens导致的食物中毒多与水、肉和禽肉制品相关。调查美国1998―2010年由C.perfringens引起食物中毒的结果显示，肉类食品占食物总量的92％，其中牛肉制品占46％，禽肉制品占30％，猪肉制品占16％。据报道，生鲜牛肉、猪肉、火鸡肉和鸡肉及各种肉制品中C.perfringens检出率均超过10％，部分日本鸡肉中检出率甚至高达84％。最常见C.perfringens引起食物中毒的错误操作发生于食物加工和准备的过程中，占所有因素的93％。比如，肉制品煮制后经过不适当冷却工艺(44％)；将肉制品放置于不合适贮藏温度下(22％)。

16s RNA基因具有高度保守和存在的普遍性，以及核酸序列本身的稳定性，序列分析的重现性极高，进化速度十分缓慢，被称为细菌的“活化石”，以往检测细菌数量较多使用都是16s RNA。但是，然而随着研究的深入,16SrRNA基因也表现出了不容忽视的缺点:高保守性使其不能很好的区分亲缘关系较近的物种；在基因组内的多拷贝性使确定其序列的准确性降低。因此在进行更精确地分类鉴定和以及计算细菌某个毒力基因拷贝数时就很难确定。为弥补16SrRNA基因的缺点,人们开始尝试使用其他不同的看家基因(如recA基因等)进行放线菌的分子生物学分析。recA是原核生物同源重组的中心分子,为单拷贝基因，在DNA重组和DNA损伤应急修复(SOS)过程中是一个关键的基因,常用于做细菌分型。本发明将其作为产气荚膜梭菌的看家基因作为其分子鉴定基因，同时开展双重数字PCR检测其他毒力基因，从而不仅有效确定菌肿，而且还可以对毒力基因含量进行一个评估。

DNA促旋酶又叫螺旋酶(由gyrA基因编码)，为原核生物拓扑异构酶Ⅱ，在基DNA的复制过程中起了很重要的作用。在无ATP时，切断处于超螺旋状态的DNA分子，使超螺旋松弛；在有ATP时，利用ATP使松弛状态的DNA进入负超螺旋结构。同时杆菌对氟喹诺酮类药物产生耐药机制主要包括编码靶酶DNA促旋酶和拓扑异构酶的基因突变；细菌膜通透性的降低以及膜的主动外排泵激活。

由于产气荚膜梭菌属于厌氧菌，其培养要求较高,需要特殊的厌氧培养条件和设备,加上还需要采取特殊采样方式、应用相应培养基、鉴定试剂等,一般的实验室难以开展对该菌的研究,故长期以来国内对厌氧菌及其在食物中毒中的作用也缺少认识。在政府和民众重视食品安全的今天,对食品中厌氧菌的危险性应该进行评估。