[发明专利]直接检测茶叶糖苷结合态香气前体物质的方法

权利要求书

1.直接检测茶叶糖苷结合态香气前体物质的方法，其特征是：以茶鲜叶、或茶在制品、或成品茶作为待测样品，依次进行以下步骤：

1)、待测样品中糖苷结合态香气前体提取：

将0.05-0.1g干重的待测样品利用20mL提取剂进行提取，提取液经离心，得上清液；所述提取剂为预冷的体积浓度为90-95％甲醇；

在上清液中添加3μg 4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷作为内标，并加入0.1-0.2g经超纯水预溶胀的不溶性聚乙烯吡咯烷酮PVPP充分混匀，静置后离心，离心所得的上清浓缩至干，得浸膏；将浸膏溶于1-2mL超纯水中，并过0.22μm微孔滤膜，得茶叶糖苷结合态香气前体提取物；

2)、提取物中糖苷结合态香气前体UPLC-MS/MS分析：

以UPLC HSST3色谱柱为分析柱，柱温35℃，进样量5ul；以甲酸/水(0.05/99.95，v/v)为流动相A、以乙腈为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.3ml/min，洗脱时间程序为0-3min B相保持10％、3.01-15min B相从10％增加至20％、15.01-20min B相从20％增加至35％、20.01-22min B相从35％增加至90％、22.01-24min B相保持90％、24.01-26min B相保持10％；

MS分析条件为：电喷雾ESI负电离模式、毛细管电压3KV、二级锥孔电压3V、透镜电压0.2V、离子源温度150℃，脱溶剂气温度500℃、脱溶剂气流量800L/h、锥孔气流量60L/h、锥孔电压25V、碰撞气氩气流速0.25mL/min、扫描质荷比范围为100～700m/z、数据采集时间为26min；

在4-9min对应的通道1中以离子对346/138检测内标4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷、以离子对447/269检测苯甲醇樱草糖苷、以离子对491/293检测水杨酸甲酯樱草糖苷，在7-13min对应的通道2中以离子对461/149检测苯乙醇樱草糖苷、以离子对439/149检测顺3-己烯醇樱草糖苷、以离子对509/331检测芳樟醇氧化物(I和II)樱草糖苷，在13-17min对应的通道3中以离子对509/331检测芳樟醇氧化物III樱草糖苷，在17-23min对应的通道4中以离子对493/161检测芳樟醇樱草糖苷、以离子对493/149检测香叶醇樱草糖苷；

3)、茶叶糖苷结合态香气前体物质含量计算：

以4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷内标为参照，获得苯甲醇樱草糖苷、水杨酸甲酯樱草糖苷、苯乙醇樱草糖苷、顺3-己烯醇樱草糖苷、芳樟醇氧化物I樱草糖苷、芳樟醇氧化物II樱草糖苷、芳樟醇氧化物樱草糖苷III、芳樟醇樱草糖苷、香叶醇樱草糖苷这9种糖苷结合态香气前体的物质含量。

2.根据权利要求1所述的直接检测茶叶糖苷结合态香气前体物质的方法，其特征是：

所述步骤3)的公式为：内标浓度×内标体积×目标化合物峰面积/内标峰面积×提取物体积/茶叶样品干重。

3.根据权利要求1或2所述的直接检测茶叶糖苷结合态香气前体物质的方法，其特征是，所述经超纯水预溶胀的不溶性聚乙烯吡咯烷酮PVPP的制备方法为：按照超纯水：PVPP＝2.8～3.2:1的质量比，将PVPP浸泡在超纯水中静置2±0.2h；

静置结束后，去除PVPP表面的水分，得超纯水预溶胀的PVPP。

4.根据权利要求1或2所述的直接检测茶叶糖苷结合态香气前体物质的方法，其特征是：

一、当待测样品为茶鲜叶、或茶在制品时：

称取0.05-0.1g干重的待测样品，与10mL提取剂混合后，用匀浆机匀浆10-20min，然后离心，分别得首次上清液和残渣；

以残渣与10mL提取剂混合后，超声浸提10～20min，离心，吸取上清，并与首次上清液合并后作为上清液；

所述离心为5000±500r/min、4±1℃离心5±1min；

二、当待测样品为成品茶时：

将待测样品粉碎，取0.05-0.1g干重的待测样品粉末加入10mL提取剂超声浸提20±5min，然后离心，分别得首次上清液和残渣；

将残渣与10mL提取剂混合后超声浸提10～20min，离心，吸取上清，并与首次上清液合并后作为上清液；

所述离心为5000±500r/min、4±1℃离心5±1min。

5.根据权利要求1或2所述的直接检测茶叶糖苷结合态香气前体物质的方法，其特征是：

所述步骤1)中，在上清液中添加3.0μL浓度为1mg/mL的4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷溶液作为内标。