[发明专利]直接检测茶叶糖苷结合态香气前体物质的方法

说明书

本发明公开了一种可直接同时检测茶叶糖苷结合态香气前体物质的方法，以茶鲜叶、茶在制品、或成品茶作为待测样品，依次进行以下步骤：1)、待测样品中糖苷结合态香气前体提取，2)、提取物中糖苷结合态香气前体UPLC‑MS/MS分析，3)、茶叶糖苷结合态香气前体物质含量计算：以4‑硝基苯基‑β‑D‑葡萄糖苷内标为参照，获得苯甲醇樱草糖苷、水杨酸甲酯樱草糖苷、苯乙醇樱草糖苷、顺3‑己烯醇樱草糖苷、芳樟醇氧化物I樱草糖苷、芳樟醇氧化物II樱草糖苷、芳樟醇氧化物樱草糖苷III、芳樟醇樱草糖苷、香叶醇樱草糖苷这9种糖苷结合态香气前体的物质含量。该方法对糖苷结合态香气前体物质检测效率高。

技术领域

本发明涉及一种茶中糖苷结合态香气前体物质的检测方法，具体的说是一种利用超高压液相色谱-质谱/质谱(UPLC-MS/MS)多反应监测模式(MRM)直接对茶树鲜叶、茶叶在制品以及干茶的糖苷结合态香气前体物质进行快速、高效检测的方法。

背景技术

香气是重要的茶叶品质因子。茶中的香气成分主要包括醇类、醛类、酮类、酯类、杂环化合物等，其中醇类化合物是最为重要的香气组份。茶叶醇类香气物质又可分为萜烯醇、芳香醇和脂肪醇三类化合物，而且萜烯醇和芳香醇常具有花香特征，对茶叶的香气品质有重要贡献。茶叶中常见的萜烯醇有芳樟醇、芳樟醇氧化物(I、II、III、IV)、香叶醇、橙花醇、橙花叔醇等，芳香醇有苯甲醇和苯乙醇等，脂肪醇有顺3-己烯醇、庚醇、辛醇等。已有研究证实，成品茶香气主要有4种来源，其一为糖苷结合态前体水解、释放出挥发性香气，其二为长链脂肪酸通过脂氧合酶催化或自由基氧化途径形成挥发性短链脂肪醇，其三为在湿热作用下通过羰氨反应形成吡嗪、吡喃等杂环化合物，其四为茶鲜叶中既已存在的游离态香气物质，其中糖苷结合态前体水解是茶叶香气形成的最关键途径。因此糖苷结合态前体是茶叶香气潜力的重要表征成分，糖苷结合态香气前体的快速提取和准确检测方法建立对茶树品种香气品质潜力客观评价以及高香茶叶栽培加工配套技术开发有重要意义。

虽然糖苷结合态前体物质对茶叶香气贡献显著，但这类物质在茶鲜叶或者成品茶中丰度很低，分离和纯化非常困难，而且这类物质紫外吸收弱、甚至无紫外吸收，因而较难直接、准确地定性和定量。目前，茶叶糖苷结合态香气前体物质的检测主要采用酶解与气相-质谱联用(GC-MS)相结合方法、或者糖苷结合态香气前体衍生与GC-MS相结合方法、或者采用超高压液相色谱-质谱(UPLC-MS)单离子监测模式(SIM)方法等进行。其中，酶解与GC-MS检测技术，需要将茶样品中的游离态和糖苷结合态香气前体用水或缓冲液浸提出来、并用乙醚等溶剂反复萃取除去游离态的香气物质，将含有糖苷结合态香气前体的提取液与葡萄糖苷酶或果胶酶等混合、水解并释放香气物质，再用固相微萃取(SPME)或同时蒸馏萃取(SDE)等方式富集香气物质，进而通过GC-MS对萃取的香气物质进行定性和定量，这种测定方法只能间接推定结合态糖苷前体的苷元性质，不能获得糖基的信息，而且在糖苷酶解以及释放的香气富集过程中往往还存在水解不彻底、富集不完全等问题。糖苷结合态香气前体衍生与GC-MS结合分析法，主要过程为，提取和纯化茶叶等样品中的糖苷结合态香气前体，并充分干燥后与三氟乙酰胺试剂或硅烷化试剂混合进行衍生化处理引入挥发性乙酰基或硅烷基团，经GC-MS分析对衍生转化后的前体物质进行定性和定量；该方法可以获得糖苷结合态香气前体的较为完整的结构信息，但是纯化前体物质过程繁琐，而且分析数据后续处理复杂，因为GC-MS获得的是衍生后的糖苷物质信息，还需要解卷积等过程还原获得的原始糖苷前体信息。利用UPLC-MS的SIM检测糖苷结合态香气前体时，需要将茶叶中的糖苷结合态香气前体浸提出来、并通过柱层析等手段纯化后，经UPLC分离，根据糖苷结合态前体分子量特点采用SIM对单个目标物进行信号采集和定量；这种方法虽然可以直接测定糖苷结合态香气前体物质，但是，前体物质提取和纯化过程繁琐，需要尽可能多的去掉干扰性杂质，因为在前体提取物中往往存在分子量相似的干扰物质；而且这种分析方法通量低，每次只能检测一种糖苷结合态香气前体物质，一个样品需要经过多次检测才能将所含前体物质完全检测出来。到目前为止，尚缺乏快速直接的茶叶糖苷结合态香气前体物质的高效检测方法。

发明内容