[发明专利]一种玉米转抗草丁膦抗性基因成分NASBA-ELISA快速检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种玉米转抗草丁膦抗性基因成分NASBA-ELISA快速检测试剂盒，其特征在于，它包括如下体系：

1)NASBA扩增反应体系，具体包括以下组分：

(a)bar基因的一对特异性引物

bar-F：5’-GATGCAAGGTCGCATATGAG-GCCAAATGTTGAACGATCTGCAGG-3’；

bar-R：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGCACCATCGTCAACCA CTACATCG-3’，下划线为T7启动子序列；

(b)NASBA扩增缓冲液：Tris-HCl为80mmol/L，pH8.5，NTP为20mmol/L，dNTP为2mmol/L，MgCl₂为20mmol/L，KCl为240mmol/L，DTT为10mmol/L，DMSO为200g/L；

(c)NASBA扩增酶复合液：T7RNA聚合酶80U，SupeScript II反转录酶40U，核糖核酸酶H0.2U，20U RNA酶抑制剂；

2)NASBA扩增产物ELISA检测体系，具体包括以下组分：

(a)bar基因的探针

特异性探针，即捕获探针：5’-Biotin-ATGCAAGGTCGCATATGAGT-3’，

检测探针：5’-DIG-AAGTCCAGCTGCCAGAAA-3’；

(b)酶标板包被液和封闭液：链霉亲和素用0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6，稀释为0.0125mg/mL浓度作为酶标板包被液；酶标板封闭液是0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6和1％BSA混合液；

(c)杂交缓冲液：20×SSPE、pH7.4，50mmol/LTris-HCl、pH8.5，1％(W/V)BSA；

(d)杂交抗体：碱性磷酸酶抗地高辛抗体；

(e)NASBA扩增产物ELISA检测试剂：

杂交洗液PBST：PBS、pH7.2，0.05％Tween-20；

显色液：3mg pNPP于1mL ddH₂O，加入1mL二乙醇胺，-20℃避光保存；

终止液：0.5mol Na₂CO₃溶液。

2.一种玉米转抗草丁膦抗性基因成分NASBA-ELISA快速检测方法，其特征在于，它包含下述步骤：

1)设计并人工合成玉米转基因成分bar的特异引物和探针，检测时扩增混合物中的序列将分别被特异性的捕获探识别并固定于不同检测孔中，通过酶标法进行检测，人工合成的引物和探针如下：

(a)bar基因的一对特异性引物

bar-F：5’-GATGCAAGGTCGCATATGAG-GCCAAATGTTGAACGATCTGCAGG-3’；

bar-R：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGCACCATCGTCAACCA CTACATCG-3’，下划线为T7启动子序列；

特异性探针，即捕获探针：5’-Biotin-ATGCAAGGTCGCATATGAGT-3’；

检测探针：5’-DIG-AAGTCCAGCTGCCAGAAA-3’；

2)NASBA扩增模板转基因玉米总RNA的制备

液氮研磨120mg玉米叶片，加入1mLTrizol涡旋1min，室温放置15min；加500μL氯仿，颠倒混匀，室温放置5min，4℃，12000r/min离心15min；上清加入等体积异丙醇，冰浴20min，4℃，10000r/min离心10min，去上清；用75％乙醇洗涤沉淀两次，4℃，10000r/min离心5min，干燥后加50μL TE回溶；

3)NASBA扩增反应体系及程序：

(a)NASBA扩增反应液制备：20μL扩增反应液包2mmol/L dNTP，20mmol/L NTP，80mmol/LTris-HCl pH值为8.5，20mmol/L MgCl2，240mmol/L KCl，10mmol/L DTT，200g/L DMSO，上、下游引物各0.4μmol/L；

(b)酶反应液制备：5μL酶反应液包含40U SupeScript II反转录酶，80U T7 RNA聚合酶，0.2U核糖核酸酶H和20U RNA酶抑制剂；

(c)扩增反应及程序采用20μL体系：10μL扩增反应液中加入0.5μL玉米总RNA和3.5μLddH₂O，65℃加热2min去除RNA二级结构，41℃冷却2min，加入5μL酶反应液，41℃反应90min，冰浴2min终止反应后-20℃贮存，同时以无菌水做阴性对照；

(4)酶标板的制备：

(a)酶标板包被液制备：链霉亲和素用0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6，稀释为0.0125mg/mL浓度；

(b)酶标板封闭液制备：0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH8.6和1％BSA混合液；

(c)酶标板制备：96孔酶标板上每孔加入100μL链霉亲和素酶标板包被液室温过夜包被酶标板；每孔加入100μL酶标板封闭液对酶标板进行封闭，37℃恒温2h，用PBST洗板35次，4℃避光保存备用；

(5)NASBA扩增产物ELISA检测：

(a)杂交反应：每孔中各加入43μL杂交缓冲液、2μL探针混合液和5μL NASBA扩增产物，轻轻振荡混匀，41℃反应30min，并用PBST洗板3～5次，每孔加入100μL碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体1∶5000稀释，室温反应至少30min，PBST洗板3～5次；

(d)显色反应：每孔加入100μL pNPP进行显色，室温避光显色10min，立即加入100μL碳酸钠终止显色反应，酶标仪测定OD₄₀₅数值，OD≥0.27为阳性，OD＜0.27为阴性。