[发明专利]一种玉米转抗草丁膦抗性基因成分NASBA-ELISA快速检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明涉及一种生物检测技术领域，是一种玉米转抗草丁膦抗性基因成分NASBA‑ELISA快速检测试剂盒，其特点是，由根据抗草丁膦抗性基因bar的mRNA序列设计的特异性引物、捕获探针、检测探针，优化的NASBA扩增体系和优化的NASBA产物检测体系组成。能对玉米中抗草丁膦抗性基因成分进行简单快速的检测，具有高效的特异性和容易推广的优越性，也有助于转基因玉米中的抗草丁膦抗性基因成分bar的早期诊断；其检测方法是设计并人工合成抗草丁膦抗性基因bar的mRNA序列的特异性引物、捕获探针和检测探针，确定NASBA扩增反应程序和NASBA产物检测体系等步骤，检测方法避开了对特殊设备和专业人员的需求，结果灵敏度高且重复性好。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，是一种玉米转抗草丁膦抗性基因成分NASBA-ELISA快速检测试剂盒及检测方法。

背景技术

随着转基因玉米的扩大种植，其安全性也受到国际社会和广大民众的广泛关注，世界各国都制订了相应安全性评价制度和转基因成分标识制度等，要求对转基因产品进行标识，转基因成分的检测也越来越受到重视。因此，急需一种快速检测方法满足玉米产品在种植及贸易中的监控需要。

从吸水链霉菌中分离得到的bialaphos resistance(bar)基因被证明具有良好的抗草丁膦(PPT)除草剂效果，由于其非选择性、广谱、无残留的优点被广泛用于植物转基因的选择标记，bar基因也常被作为检测转基因的靶标元件。现有检测方法中，检测外源基因的表达产物常因加工过程中产品丧失抗原性导致无法检测。核酸法因其准确快速日益受关注，如聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)、实时荧光定量PCR和基因芯片等；但因需要昂贵的PCR仪及专业化的操作人员未能得到普及；基因芯片技术成本高、数据分析复杂。因此，找到一种简单快速高效的诊断方法势在必行。一种特异性等温扩增RNA的核酸序列依赖性扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)技术已有成功应用的报道，它是由一对特异性引物介导的、连续均一的、体外特异核苷酸序列等温扩增的酶促反应过程。反应在41℃恒温下进行，可在2h内将模板RNA扩增约10¹²倍，且无需PCR仪等仪器，避免了PCR扩增结果重复性差的问题，也容易普及应用。

本发明根据玉米转基因成分bar的mRNA基因序列设计了特异引物和探针，将高效的NASBA和简便的酶联检测法完美结合，研发出高效的NASBA检测转基因成分bar的快速检测试剂盒，短时间内对转基因成分bar进行高灵敏度筛查，灵敏度达到5fg，其操作简单、对设备要求低等优点适合在基层部门和采样现场普及应用。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种操作简便、快速、灵敏度高、特异性强，效果佳，应用价值高的玉米转抗草丁膦抗性基因成分NASBA-ELISA快速检测试剂盒，并提供其检测方法。

本发明的目的是由以下技术方案来实现的：

一种玉米转抗草丁膦抗性基因成分NASBA-ELISA快速检测试剂盒，它包括如下体系：

1)NASBA扩增反应体系，具体包括以下组分：

(a)bar基因的一对特异性引物

bar-F：5’-GATGCAAGGTCGCATATGAG-GCCAAATGTTGAACGATCTGCAGG-3’；

bar-R：5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGCACCATCGTCAACCA CTACATCG-3’，下划线为T7启动子序列；