[发明专利]一种微小隐孢子虫荧光LAMP检测方法

说明书

本发明为一种微小隐孢子虫荧光LAMP检测方法，其特异、灵敏、检测成本低、耗时短、高效、操作简便。本发明采用的技术方案为：（1）微小隐孢子虫SSU RNA、COWP、actin、HSP70基因位点的特异性引物的筛选确定；（2）设计合成微小隐孢子虫荧光LAMP的引物，并进行反应条件的优化和标准曲线和熔解曲线的绘制；（3）特异、敏感性和重复性试验以及临床样品的检测应用。

一、技术领域：

本发明涉及生物检测方法，具体涉及一种微小隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)的简便、灵敏、特异、快速检测方法，能够广泛应用于人、动物以及各种环境中微小隐孢子虫的快速检测。

二、背景技术：

隐孢子虫(Cryptosporidium)作为一种广泛寄生于人和多种动物消化道的原虫，主要引起宿主腹泻为主的综合征，造成营养不良、生长滞缓。而作为人兽共患种之一的微小隐孢子虫(C.parvum)，不仅可以通过动物的奶、肉以及毛皮等动物性制品感染人，而且也可通过其粪便污染水源，给人类健康和公共卫生构成严重威胁。研究表明，世界各地数百种动物以及人类中均可遭受隐孢子虫感染。在世界范围内，从1984年至今因病畜粪便污染饮水和食物而引发的暴发性和散发性隐孢子虫病例报道据不完全统计有近百起，最严重的一次是美国威斯康星州密尔沃基市因自来水水源被污染而引起的隐孢子虫病暴发，160万的城市人口中近40万人感染，死亡近百人。我们通过对陕西省不同地区，不同品种家禽家畜(山羊、牛、鸡)的隐孢子虫感染研究发现，均存在微小隐孢子虫(C.parvum)的感染。

目前，临床上检测隐孢子虫的常用方法主要有传统显微形态学观察，酶联免疫吸附试验和直接免疫荧光抗体试验等免疫学方法以及常规PCR、巢式PCR、多重PCR、Real-timePCR、多重Real-time PCR等分子生物学方法。传统形态学显微观察耗时耗力检出率也较低，而且也需要具备一定的专业知识。免疫学方法和基于PCR的分子生物学方法虽灵敏、特异，可有效的区分隐孢子虫种类，但检测成本非常高，需要较多昂贵的仪器(酶标仪、荧光显微镜、PCR仪、凝胶成像系统、荧光定量PCR仪等)，因此，在基层应用推广中很难被接受。鉴于此，本发明根据2000年Notomi博士发明的一种新型的核酸体外扩增技术——环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)，建立一种特异、灵敏、检测成本低、耗时短、高效、操作简便的微小隐孢子虫荧光LAMP检测方法。

三、发明内容

本发明的目的在于提供一种微小隐孢子虫荧光LAMP检测方法，其特异、灵敏、检测成本低、耗时短、高效、操作简便。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种微小隐孢子虫荧光LAMP检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)微小隐孢子虫不同基因位点SSU RNA、COWP、actin、HSP70的特异性引物的筛选确定；

(2)设计合成微小隐孢子虫荧光LAMP的引物，并进行反应条件的优化和标准曲线和熔解曲线的绘制；

(3)特异、敏感性和重复性试验以及临床样品的检测应用。

所述的上述步骤的具体步骤为：

(1)微小隐孢子虫不同基因位点的特异性引物筛选确定，引物序列见表1；

(2)根据步骤(1)所确定的微小隐孢子虫特异性PCR扩增引物，以及进行扩增产物的电泳检测；

(3)根据步骤(1)和步骤(2)的试验数据，设计合成微小隐孢子虫荧光LAMP的引物，微小隐孢子虫荧光LAMP的引物见表2；

(4)对设计合成的特异性引物进行灵敏度实验；

(5)对设计合成的特异性引物进行特异性实验；