[发明专利]一种神经干细胞球玻璃化冻存/复苏方法

说明书

本发明提供了一种神经干细胞球玻璃化冻存及复苏的方法，将神经干细胞球贴附于细胞球收集片；然后将细胞球收集片于冻存液中孵育后液氮冷冻，然后转入冻存管中于液氮中保存；复苏时，将细胞球收集片在复苏培养基中孵育复苏，以神经干细胞完全培养基培养后传代，再按照正常方式培养、传代；所述细胞球收集片，包括贴壁面和支架；所述贴壁面为长方形；所述支架与贴壁面的短边垂直相连，呈L型；所述支架高度小于贴壁面长度。本发明提供的神经干细胞球玻璃化冻存和复苏方法，可将神经干细胞球高密度束缚于一个较小的贴壁面，达到了玻璃化冻存的前提条件，并且细胞球摊开贴壁有效减小了神经球的厚度，提高了冻存保护剂的渗透效率。

技术领域

本发明属于细胞保存领域，具体涉及一种神经干细胞球玻璃化冻存/复苏方法。

背景技术

细胞冻存是将细胞储存于低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，利用冻存技术将细胞置于液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。

实验室培养的细胞在放于液氮或超低温冰箱之前，需首先按照适宜的程序进行降温过程，方能最大限度的防止细胞损伤，降低细胞在降温环节中受到的冰晶损伤、溶质损伤。当前广泛使用的细胞冷冻程序主要包括两种：程序降温即慢速冷冻以及玻璃化冷冻。两者共同点为都需要使用渗透型及非渗透型冷冻保护剂以减少细胞内外在降温过程中的冰晶形成及因温度降低导致溶液中离子浓度增加而对细胞形成的溶质损伤。其中慢速冷冻发展较早，技术成熟，细胞添加冷冻保护剂后使用程序降温仪或程序降温盒按照既定程序缓慢降温，达到-80℃后转入液氮长期保存，目前已在大部分类型细胞冻存中取得了良好的效果；而玻璃化冻存则是一种快速冷冻技术，将细胞或组织添加高浓度冷冻保护剂后直接投入液氮，在极快的降温过程中，使高浓度的冷冻保护剂变为粘度很强的玻璃化状态，避免了细胞内外冰晶的形成，达到保护细胞的目的，显著提高存储细胞的复苏率。然而玻璃化冻存需要采用特殊装置，如冷冻环、铜网、拉细麦管等，冻存细胞量有限、操作较复杂，而且有些耗材价格昂贵，近年来主要在胚胎、卵母细胞、精子等辅助生殖领域应用。

神经干细胞是中枢神经系统内是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞，能够分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，从而能够产生大量脑细胞组织，并能进行自我更新，足以提供大量脑组织细胞的细胞群。神经干细胞体外培养技术为帕金森症、老年痴呆症、脑瘫等疾病的细胞移植治疗提供了可能。当前神经干细胞体外培养主要有两种方法：神经干细胞球法和贴壁法。神经干细胞球法即悬浮培养法是神经干细胞培养的经典方法，因神经干细胞本身特性，在培养过程中神经干细胞会自发聚集成球并不断扩增；贴壁法则是在培养过程中用黏附因子包被培养瓶，使细胞单层贴壁培养。其中神经干细胞球法因其易操作、高密度培养、不易分化等特点，目前仍是神经干细胞体外培养的主流方法。

神经干细胞体外培养时较其他类型干细胞脆弱，冻存复苏过程细胞损失率大。神经干细胞球培养法为悬浮培养，冻存时可选择细胞生长对数期、活性高阶段，无需酶解直接冻存，有效避免损伤，并提高冻存密度。然而，用传统方法冻存，低浓度保护剂难以有效渗透至细胞球内部，冻存过程内部细胞损伤极大。而采用酶解或机械剪切方法处理细胞球又会给细胞造成较大损伤，得不偿失。神经干细胞冻存复苏问题一直给科研人员造成极大困扰。因此，理想的神经干细胞冻存方法应该做到：无需酶解、冻存保护剂有效渗透进入细胞内部、设计简便装置用玻璃化冻存代替慢速降温。目前尚无神经干细胞球相关玻璃化冻存方法与配套仪器的报道。

发明内容

针对神经干细胞球在冻存过程中，冻存保护剂难以渗透进入细胞球内部，降温过程中内部细胞损伤大等问题，本发明提供一种神经干细胞球玻璃化冻存及复苏方法，细胞复苏率高、复苏后活性好。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种神经干细胞球玻璃化冻存及复苏方法，包括以下步骤：