[发明专利]用于空间上测量纳米级结构的方法和设备

说明书

一种空间上测量样品中的多个纳米级结构的方法，所述包括步骤：利用荧光标记(1)在不同位置处标记各个结构；将各个结构耦接(2)到各个定位辅助件，所述定位辅助件在样品中的位置是已知的；利用激发光激发荧光标记从而发射荧光，其中，激发光的强度分布具有局部最小值；将局部最小值布置(3)在围绕相应的定位辅助件的位置的近距离范围中的不同位置处，所述近距离范围的尺寸不大于激发光的波长下的衍射极限；针对各个荧光标记以及针对最小值的不同位置单独地记录从样品发射出的荧光；以及从记录的荧光的强度确定各个荧光标记在样品中的位置。

技术领域

本发明涉及一种空间上测量样品中的至少一个纳米级结构的方法并且涉及一种用于实施这种方法的设备。

特别地，所述方法包括步骤：用荧光标记在不同位置处标记至少一个纳米级结构；利用激发光激发荧光标记从而发射荧光；记录从样品发射出的荧光；以及从记录的荧光的强度确定各个荧光标记在样品中的位置。

更特别地，本发明涉及一种方法，其中，确定各个荧光标记在样品中的位置以超过激发光的波长和荧光的波长下的衍射极限的精度执行。

背景技术

已知一种被称为MINFLUX显微术的空间上测量样品中的至少一个纳米级结构的方法，其中，以超过激发光的波长和荧光的波长下的衍射极限的精度确定样品中的各个的荧光标记的位置，见Balzarotti F,Eilers Y,Gwosch KC,AH,Westphal V,StefaniFD,Elf J,Hell SW的Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescentmolecules with minimal photon fluxes(《纳米分辨率成像和光子通量最小的荧光分子追踪》)，Science 355，2016年12月22日在线发布。在MINFLUX显微术中，通过以下方式确定各个荧光标记的位置：将激发光的强度分布的零点布置在各个荧光标记的估计位置周围的测量区域的中心处以及在测量区域的边界处围绕中心均匀分布的三个位置处。在该总共四个零点位置处，单独地测量来自相应的荧光标记的荧光的强度，并且从对于零点的不同位置分别记录的各个荧光标记的荧光的强度来确定各个荧光标记的位置。零点的四个位置布置得越紧密且仍跨越了相应荧光标记的目标位置，越能够精确地从针对零点位置中的每一个记录的荧光的仅少许光子确定荧光标记的位置。

在搜索多种物质是否包括具有关于其他物质或生物物体的特定性质的物质的所谓的药物筛选和其它方法中，物质与其它物质或者与物体的多个副本分别接触多次，并且监测其它物质或物体的产生的反应。由于需要多个相同的配对以获得统计学显着的结果，并且另一方面，由于这些物质通常应该显示其相对于不同其它物质或不同生物物质的期望的性质，所以待监测的反应的总数通常等于多个待搜索的物质的数量。一般地，系统地确定数量如此多的反应是费时费力的。通常，分子级别的反应仅可以借助分析反应来确定。从而监测反应动态经常是不可能的。

WO 2014/108455 A1公开了一种对用荧光标记标记的样品的结构执行空间高分辨率成像方法，其中，样品例如在STED荧光显微术中经受激发光和作为荧光抑制光的刺激光，以将样品的面积限界到刺激光的零点的面积，样品的面积可以被分配从样品发射出的并检测到的荧光。为了保护荧光标记免受邻近零点的强度最大值区域内的刺激光的高强度，样品附加地经受激发抑制光，其强度分布具有与刺激光的零点一致的局部最小值。该激发抑制光特别地可以作为关断光，其将激发抑制光的最小值以外的可切换的荧光标记关断为非活跃状态，在该非活跃状态下，它们不能被激发光激发来发射荧光。特别地，荧光标记可以是如高分辨率RESOLFT荧光显微术中所使用的那样的可切换的荧光染料。