[发明专利]一种具有生物活性的胶原的质量控制方法

说明书

本发明公开了一种具有生物活性的胶原的质量控制方法。本发明采用酸性酶解的条件实现了对牛筋腱I型胶原的高效提取，优化胶原的生产工艺，通过改变酶反应时间、透析时间以及透析袋截留分子量大小，控制胶原的分子量及分子量分布；通过去端肽控制胶原的免疫原性；通过透射电镜表征胶原的三螺旋结构确定胶原的生物活性，所制备的活性I型胶原蛋白已达到国际水平，为胶原的进一步应用提供了基础。

技术领域

本发明涉及胶原提取技术领域，具体涉及一种具有生物活性的胶原的质量控制方法。

背景技术

胶原蛋白是动物体内含量最多、分布最广的蛋白质，广泛存在于结缔组织、皮肤、骨骼、内脏及肌腱、韧带、巩膜等部位，是细胞外基质的主要组成成分，其中Ⅰ型胶原应用最为广泛。胶原具有低免疫源性、降解可控性、降解产物无毒无害，包含有促进细胞粘附和生长的RGD(由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸组成)结构域，可诱导细胞迁移，刺激细胞增殖，是较早通过FDA及SFDA批准的生物材料之一。活性胶原可与纤维蛋白，糖胺多糖、壳聚糖、海藻酸盐等构建成复合支架，或负载生长因子如bFGF、BMP，或负载基因、干细胞等，用于促进骨、肌肉、人工血管、神经、角膜等组织的修复，在创伤敷料、人工皮肤以及药物释放等领域具有非常广阔的应用前景。

胶原的提取方法主要包括酸提取法、碱法、盐法及酶法，而胶原生物活性与其分子量质量大小和三股螺旋结构密切相关，如何保持胶原的生物活性是提取过程的关键，因此，有必要对胶原的提取过程进行优化，提高胶原生物活性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种具有生物活性的胶原的质量控制方法，优化胶原提取工艺参数，提高胶原的生物活性。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种具有生物活性的胶原的质量控制方法，包括以下步骤：

(1)筋腱预处理：对筋腱进行脱脂、切片和消毒处理；

(2)胶原的提取：将经步骤(1)预处理后的筋腱进行粉碎，在粉碎的筋腱中加入0.5～1.0mol/L的乙酸和1000～3000U/L的胃蛋白酶进行酶解，去除端肽，酶解温度为10℃～30℃，酶解反应时间为48～144h，离心后取上清液；

(3)胶原的纯化：将步骤(2)中的上清液进行盐析和沉淀处理，将沉淀再次用0.1～0.5mol/L的乙酸或0.05～0.1mol/L的盐酸酸解，离心取上清液，并进行脱盐处理，得到胶原溶液；

(4)透析：将胶原溶液装入透析袋中，透析袋的截留分子量为50～100kDa，用纯化水或pH 4.5～5.0的醋酸盐缓冲液作为透析外液，透析2～5天，得到所述具有生物活性的胶原原液。

上述技术方案采用酸性酶解的条件实现了对筋腱I型胶原的高效提取，通过改变酶反应时间、透析的时间以及透析袋截留分子量大小，优化生产工艺，控制胶原的分子量及分子量分布；通过酸性条件下胃蛋白酶的作用切除胶原的端肽结构，从而控制胶原的免疫原性。

作为本发明所述胶原的质量控制方法的优选实施方式，还包括对所述具有生物活性的胶原进行分子量测定、端肽去除检测和三螺旋结构鉴定的步骤。

研究表明，根据本技术方案获得的胶原蛋白分子量在90kDa以上的蛋白不少于80％，胶原蛋白具有较高的生物活性。

胶原应用于钛合金表面涂层时，胶原涂层在钛合金表面的均一性与胶原分子量分布相关，胶原分子量分布越窄，胶原涂层在钛合金表面涂布越均匀。因此控制胶原的分子量对胶原涂层的均一性和生物活性具有重要意义。

胶原的主要免疫原性位点是在胶原两端的非螺旋氨基酸区域，又叫端肽。为将低胶原的免疫原性，在提取胶原时使用胃蛋白酶选择性地切除端肽。因此，检测胶原的端肽去除情况，对其安全性非常重要。