[发明专利]一种枯草芽孢杆菌表达的牛分支杆菌ESAT-6蛋白及其制备方法

权利要求书

1.一种枯草芽孢杆菌表达的牛分支杆菌ESAT-6蛋白，其特征在于，所述ESAT-6蛋白是通过以下方法制备得到的：将牛分支杆菌ESAT-6基因，插入到pNC-HisE载体中，得到ESAT-6-pNC-HisE表达载体，并将ESAT-6-pNC-HisE表达载体转化入枯草芽孢杆菌中，得到含ESAT-6-pNC-HisE表达载体的阳性枯草芽孢杆菌，然后将上述阳性枯草芽孢杆菌单菌落经LB培养基培养后，接种到TM培养基，无需诱导，获得的菌液经纯化后得到融合表达的牛分支杆菌ESAT-6蛋白，所述牛分支杆菌ESAT-6基因序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌表达的牛分支杆菌ESAT-6蛋白，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌在LB培养基中30～37℃培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8，然后取菌液按1％的体积比例加入TM培养基，33～37℃培养48～64h，将菌液离心取上清，经纯化后获得融合表达的牛分支杆菌ESAT-6蛋白。

3.根据权利要求1或2所述的一种枯草芽孢杆菌表达的牛分支杆菌ESAT-6蛋白，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌菌株为枯草芽孢杆菌B.subtilis RIK1285。

4.一种权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌表达的牛分支杆菌ESAT-6蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)通过PCR方法获得牛分支杆菌ESAT-6基因序列，将其连接到pNC-HisE载体中，得到ESAT-6-pNC-HisE表达载体；所述牛分支杆菌ESAT-6基因序列如SEQ ID No.1所示；

2)将ESAT-6-pNC-HisE表达载体转化入枯草芽孢杆菌中，在30～37℃培养16～20h后，得到含ESAT-6-pNC-HisE表达载体的阳性枯草芽孢杆菌；

3)将含ESAT-6-pNC-HisE表达载体的阳性枯草芽孢杆菌的单菌落接种于LB培养基中，30～37℃培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8，取菌液按1％的体积比例加入TM培养基中，无需诱导，33～37℃培养48～64h，离心取上清，并对上清进行纯化，得到融合表达的牛分支杆菌ESAT-6蛋白。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述PCR方法中用的模板为患肺结核病鹿的肺脏组织DNA，上游引物序列如SEQ ID NO.2所示；下游引物序列如SEQ IDNO.3所示。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述PCR获得的牛分支杆菌ESAT-6基因经BamHI与EcoRI双酶切后与经同样酶切后的pNC-HisE载体DNA进行连接。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述枯草芽孢杆菌菌株为枯草芽孢杆菌B.subtilis RIK1285。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述纯化是利用HisTrap FFCrude柱纯化进行的，具体是指用含有10mM咪唑的柱结合液洗3～5CV，再用含500mM咪唑的柱洗脱液洗脱获得ESAT-6蛋白。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述柱结合液配方为：20mM磷酸钠、500mM氯化钠和10mM咪唑，pH7.4；柱洗脱液配方为：20mM磷酸钠、500mM氯化钠和500mM咪唑，pH7.4。

10.一种表达牛分支杆菌ESAT-6蛋白的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌含有ESAT-6-pNC-HisE表达载体，所述ESAT-6-pNC-HisE表达载体是由牛分支杆菌ESAT-6基因，经BamHI与EcoRI双酶切后，与经同样酶切的pNC-HisE载体大片段连接获得的，所述牛分支杆菌ESAT-6基因序列如SEQ ID No.1所示。