[发明专利]一种枯草芽孢杆菌表达的牛分支杆菌ESAT-6蛋白及其制备方法

说明书

一种枯草芽孢杆菌表达的牛分支杆菌ESAT‑6蛋白及其制备方法，属于微生物领域。针对目前牛分支杆菌ESAT‑6可溶性蛋白制备方法复杂的问题，本发明将牛分支杆菌ESAT‑6基因，插入到pNC‑HisE载体中，得到ESAT‑6‑pNC‑HisE表达载体，并将ESAT‑6‑pNC‑HisE表达载体转化入枯草芽孢杆菌中，得到含ESAT‑6‑pNC‑HisE表达载体的阳性枯草芽孢杆菌，然后将上述阳性枯草芽孢杆菌单菌落接种于LB培养基中培养后，取菌液加入TM培养基，不需诱导，33～37℃培养48～64h，将菌液离心取上清，经纯化后获得牛分支杆菌ESAT‑6蛋白。本发明可用于制备ESAT‑6可溶性蛋白。

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种牛分支杆菌ESAT-6蛋白及其制备方法。

背景技术

早期分泌型蛋白ESAT-6是牛分支杆菌的主要免疫优势抗原，主要在牛分支杆菌感染早起分泌表达的一种抗原；卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)是可用于防治结核病的减毒活疫苗，使用活的无毒牛型结核杆菌(Mycobacterium bovis)制成，有足够高的免疫原性，可在一定程度上预防结核，但免疫动物后效果不稳定，动物机体接种BCG后会对皮内结核菌素反应的特异性产生严重干扰，因此用PPD皮试无法将疫苗接种与自然感染区分开来，但是卡介苗具有ESAT-6基因缺失，不能表达该蛋白，这一特征使其在牛分支杆菌导致的结核病早期诊断中有良好的应用前景。

发明内容

本发明针对目前牛分支杆菌ESAT-6可溶性蛋白制备方法复杂的问题，提供了一种枯草芽孢杆菌表达的牛分支杆菌ESAT-6蛋白及其制备方法。

本发明所述的枯草芽孢杆菌表达的牛分支杆菌ESAT-6蛋白是通过以下方法制备得到的：将牛分支杆菌ESAT-6基因，插入到pNC-HisE载体中，得到ESAT-6-pNC-HisE表达载体，并将ESAT-6-pNC-HisE表达载体转化入枯草芽孢杆菌中，得到含ESAT-6-pNC-HisE表达载体的阳性枯草芽孢杆菌，然后将上述阳性枯草芽孢杆菌单菌落经LB培养基培养后，接种到TM培养基，无需诱导，获得的菌液经纯化后得到融合表达的牛分支杆菌ESAT-6蛋白，所述牛分支杆菌ESAT-6基因序列如SEQ ID No.1所示。

优选地，所述枯草芽孢杆菌在LB培养基中30～37℃培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8，然后取菌液按1％的体积比例加入TM培养基，33～37℃培养48～64h，将菌液离心取上清，经纯化后获得融合表达的牛分支杆菌ESAT-6蛋白。

优选地，所述枯草芽孢杆菌菌株为枯草芽孢杆菌B.subtilis RIK1285。

本发明所述的枯草芽孢杆菌表达的牛分支杆菌ESAT-6蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1)通过PCR方法获得牛分支杆菌ESAT-6基因序列，将其连接到pNC-HisE载体中，得到ESAT-6-pNC-HisE表达载体；所述牛分支杆菌ESAT-6基因序列如SEQ ID No.1所示；

2)将ESAT-6-pNC-HisE表达载体转化入枯草芽孢杆菌中，在30～37℃培养16～20h后，得到含ESAT-6-pNC-HisE表达载体的阳性枯草芽孢杆菌；

3)将含ESAT-6-pNC-HisE表达载体的阳性枯草芽孢杆菌的单菌落接种于LB培养基中，30～37℃培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8，取菌液按1％的体积比例加入TM培养基中，无需诱导，33～37℃培养48～64h，离心取上清，并对上清进行纯化，得到融合表达的牛分支杆菌ESAT-6蛋白。

进一步地，步骤1)所述PCR方法用的模板为患肺结核病鹿的肺脏组织DNA，上游引物序列如SEQ ID NO.2所示；下游引物序列如SEQ ID NO.3所示。