[发明专利]一种快速分离甘蔗宿根矮化病致病菌Lxx的方法

权利要求书

1.一种快速分离甘蔗宿根矮化病致病菌Lxx的方法，其特征在于，包括如下步骤：

纳米磁珠的制备：取FeSO₄和FeCl₃混合倒入三口烧瓶置于恒温加热磁力搅拌器上，在充氮气的条件下搅拌到溶解，调pH值至为8-10，溶液立即变为黑色，继续反应，制得磁性纳米颗粒；置于磁场中弃上清液后，用去离子水洗涤后干燥；

纳米磁珠的氨基化：取上述所得磁性纳米颗粒，溶解在无水乙醇中，超声波处理至完全分散，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，调节pH值为10-12，在水浴中搅拌反应过夜；结束后用去离子水反覆洗涤后冷冻干燥，得到氨基化的Fe₃O₄纳米粒子；

氨基化纳米磁珠活化：取上述所得氨基化的Fe₃O₄纳米粒子溶于PBS，超声得到分散性好的磁珠溶液，加入戊二醛，于室温下搅拌反应；再PBS洗涤后用磁石收集，定容，得到活化后的氨基化纳米磁珠；

Lxx免疫磁珠的制备：将Lxx多克隆抗体加入到上述所得活化后的氨基化纳米磁珠中后搅拌，再用PBS洗涤后用磁石收集得到Lxx免疫磁珠；

Lxx的分离：将过滤后的蔗汁加入到所得Lxx免疫磁珠中混匀后孵育，低速离心弃上清，用PBS缓冲液清洗后获得Lxx的分离物。

2.如权利要求1所述快速分离甘蔗宿根矮化病致病菌Lxx的方法，其特征在于，所述纳米磁珠的制备步骤中，FeSO₄和FeCl₃的摩尔比为2：(2-6)；优选的，FeSO₄和FeCl₃的摩尔比为2:3。

任选的，调节pH值时的温度为70-80℃；优选的，温度为75℃；

任选的，继续反应30min；

任选的，用去离子水洗涤三次后干燥。

3.如权利要求1所述快速分离甘蔗宿根矮化病致病菌Lxx的方法，其特征在于，所述纳米磁珠的氨基化步骤中，所述磁性纳米颗粒：无水乙醇：3-氨丙基三乙氧基硅烷的用量比为(40-60)mg：(80-120)mL：(5-8)mL；优选的，磁性纳米颗粒：无水乙醇：3-氨丙基三乙氧基硅烷的用量比为50mg：100mL：6mL；

任选的，用氨水调节pH值为10-12；优选的，用氨水调节pH值为11；

任选的，水浴的温度为50-70℃；优选的，水浴的温度为60℃。

4.如权利要求1所述快速分离甘蔗宿根矮化病致病菌Lxx的方法，其特征在于，所述氨基化纳米磁珠活化步骤中，所述氨基化的Fe₃O₄纳米粒子：PBS：25％戊二醛的用量比为(8-15)mg：(8-15)mL：(2-3)mL；优选的，氨基化的Fe₃O₄纳米粒子：PBS：25％戊二醛的用量比为10mg：10mL：2.5mL；其中PBS的浓度为0.01M，pH值为7.4；

任选的，搅拌反应的时间为6h；

任选的，洗涤的次数为3次。

5.如权利要求1所述快速分离甘蔗宿根矮化病致病菌Lxx的方法，其特征在于，所述Lxx免疫磁珠的制备步骤中，所述Lxx多克隆抗体的制备方法为：

Lxx抗原制备：将过滤后的蔗汁涂布于含有萘啶酸的新鲜MSC培养基，暗培养，30-50天后观察并挑取菌落；

Lxx抗体制备：利用上述挑取的菌落加入0.4％的甲醛灭活，加入弗氏佐剂，直接注射兔子，两周打一次，共免疫4次，二个月后抽取血清采用Protein A-Sepharose 4B作亲和层析介质纯化得到抗体；

优选的，所述过滤后的蔗汁为切取甘蔗茎基部，进行表面清洗灭菌后放入超净台中晾干；将蔗茎切成适合大小用镊子挤汁，4000r/min，离心10min后收集蔗汁，用普通滤纸进行初步过滤后再用0.45μm细菌过滤器进行过滤。