[发明专利]一种快速分离甘蔗宿根矮化病致病菌Lxx的方法

说明书

本发明公开了一种快速分离甘蔗宿根矮化病致病菌Lxx的方法。采用FeSO₄和FeCl₃制得磁性纳米颗粒，加入3‑氨丙基三乙氧基硅烷，调pH值，搅拌；洗涤干燥，得到氨基化的Fe₃O₄纳米粒子；再加入戊二醛反应，加入Lxx多克隆抗体后搅拌，洗涤后用磁石收集；将过滤后的蔗汁加入其中混匀后孵育，离心弃上清，用PBS缓冲液清洗后获得Lxx。本发明方法具有分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单、不需要昂贵的仪器设备、污染率低等优点，更重要的是可在不改变细菌状态下快速将Lxx病原菌从甘蔗中分离出来，用于研究在当下状态下细菌的转录组和代谢组，解决了细菌与病原菌互作过程中无法快速获得大量病原菌的问题。

技术领域

本发明涉及菌株分离方法，尤其涉及一种快速分离甘蔗宿根矮化病致病菌Lxx的方法。

背景技术

甘蔗宿根矮化病(Ratoon Stunting Disease,RSD)的致病菌的体外培养非常困难，尽管在1944年就发现，但是一直到1980年Davis才成功分离培养。我国有关RSD病原菌分离培养的报道较少，2008年陈健文等利用改良的SC培养基,从甘蔗蔗汁中分离培养到一种杆状细菌,根据菌落的形态特征,并结合血清学和PCR检测方法,确认所分离到的菌是甘蔗宿根矮化病的致病菌Lxx；2015年张小秋等利用改良的MSC培养基成功分离Lxx，同年王丽也成功分离了RSD病原菌。

目前仍然还有很多实验室没有办法重复分离Lxx，主要原因是该菌本身生长特别缓慢，往往需要4周左右的时间才能在培养皿上观察到菌落，由于培养时候长，一旦有杂菌产生，分离就失败，所以控制污染是Lxx菌分离培养的关键环节，相对于其它细菌来说这种分离培养的可重复性较差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单、不需要昂贵的仪器设备、污染率低的快速分离甘蔗宿根矮化病致病菌Lxx的方法。

为实现上述目的，本发明提供一种快速分离甘蔗宿根矮化病致病菌Lxx的方法，其特征在于，包括如下步骤：

纳米磁珠的制备：取FeSO₄和FeCl₃混合倒入三口烧瓶置于恒温加热磁力搅拌器上，在充氮气的条件下搅拌到溶解，调pH值至为8-10，溶液立即变为黑色，继续反应，制得磁性纳米颗粒；置于磁场中弃上清液后，用去离子水洗涤后干燥；

纳米磁珠的氨基化：取上述所得磁性纳米颗粒，溶解在无水乙醇中，超声波处理至完全分散，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，调节pH值为10-12，在水浴中搅拌反应过夜；结束后用去离子水反覆洗涤后冷冻干燥，得到氨基化的Fe₃O₄纳米粒子；

氨基化纳米磁珠活化：取上述所得氨基化的Fe₃O₄纳米粒子溶于PBS，超声得到分散性好的磁珠溶液，加入戊二醛，于室温下搅拌反应；再PBS洗涤后用磁石收集，定容，得到活化后的氨基化纳米磁珠；

Lxx免疫磁珠的制备：将Lxx多克隆抗体加入到上述所得活化后的氨基化纳米磁珠中后搅拌，再用PBS洗涤后用磁石收集得到Lxx免疫磁珠；

Lxx的分离：将过滤后的蔗汁加入到所得Lxx免疫磁珠中混匀后孵育，低速离心弃上清，用PBS缓冲液清洗后获得Lxx的分离物。

进一步，所述纳米磁珠的制备步骤中，FeSO₄和FeCl₃的摩尔比为2：(2-6)；优选的，FeSO₄和FeCl₃的摩尔比为2:3。

任选的，调节pH值时的温度为70-80℃；优选的，温度为75℃；

任选的，继续反应30min；

任选的，用去离子水洗涤三次后干燥。