[发明专利]棕榈酰辅酶A的生物化学合成及纯化方法

说明书

本发明公开了一种棕榈酰辅酶A的生物化学合成及纯化方法。本发明所述棕榈酰辅酶A的生物化学合成方法，包括：在磷酸钾缓冲液中依次加入ATP钠盐、辅酶A、棕榈酸和乙酰辅酶A合成酶，调整pH，定容，进行反应，收集反应产物即得。本发明进一步对反应产物进行纯化，包括：将反应产物过镍柱除去蛋白，将除蛋白后的产物加入乙醚萃取，分离出的水相用离子交换树脂除去无机杂质，所得收集液冻干，得到棕榈酰辅酶A粗品；将该粗品加入到无水乙醇中搅拌，过滤出固体，真空干燥即得。本发明通过体外酶促反应合成棕榈酰辅酶A，只需一步生物化学反应，反应时间短，效率高，对产物纯化步骤简单可控，产品纯度较高，为棕榈酰辅酶A的规模化生产奠定基础。

技术领域

本发明涉及一种棕榈酰辅酶A的生物化学合成及其纯化方法，属于棕榈酰辅酶A的制备领域。

背景技术

棕榈酰辅酶A(Palmitoyl Coenzyme A,Palmityl-CoA)在科研和生产上均有广泛的应用。作为一种重要的科研试剂，棕榈酰辅酶A常被用于一些脂类相关的研究中，如细胞表面磷脂合成、细胞表面糖脂的合成、蛋白的棕榈酰化修饰、细胞信号转导等方面。工业生产上，棕榈酰辅酶A常被当做底物，用于乙酰辅酶A氧化酶活力测定。此外，棕榈酰辅酶A也常被用于一些酰基转移酶活性的测定。因此，寻找过程简单、原料成本合理、产品质量高、适合规模化生产的棕榈酰辅酶A合成与纯化工艺具有重要的意义。

目前关于棕榈酰辅酶A的合成，起初有学者通过辅酶A和棕榈酸酐反应来制备棕榈酰辅酶A，由于辅酶A自身活化点多，反应选择性较差，副产物较多，反应收率低，产品提纯困难。后来，美国专利US5519128通过棕榈酰N-琥珀酰亚胺与硅烷化辅酶A的缩合反应制备棕榈酰辅酶A，这种纯化学合成的方法过程复杂，成本较高。中国专利CN103074400B提到一种利用大肠杆菌发酵的方法来生产高附加值的棕榈酰辅酶A，在成本控制方面有很大优势，但是发酵产物中的成分过于复杂，后续提纯工艺复杂，产物的纯度只有约40％-50％。中国专利CN106543254A在棕榈酸酐反应后引入硫酯置换反应，这种方法大大提高了产品的纯度，但是反应过程耗时较长，一次反应至少需要21h，并且各反应步骤需要控制的副反应较多，反应的不确定因素增加。

因此，开发一种反应时间短、效率高的通过体外酶促反应合成棕榈酰辅酶A的新方法，然后利用化学方法对产物进行纯化，产品纯度较高，将为棕榈酰辅酶A的规模化生产奠定基础。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种棕榈酰辅酶A的生物化学合成方法，该方法通过体外酶促反应合成棕榈酰辅酶A，只需一步生物化学反应，反应时间短；本发明进一步利用化学方法对反应产物进行纯化，纯化步骤简单可控，产品纯度较高。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案包括：

本发明首先公开了一种棕榈酰辅酶A的生物化学合成方法，包括以下步骤：在磷酸钾缓冲液中依次加入ATP钠盐、辅酶A、棕榈酸和乙酰辅酶A合成酶，调整pH，定容，得到反应混合液，进行反应，收集反应产物，即得。

其中，所述ATP钠盐、辅酶A、棕榈酸、乙酰辅酶A合成酶的加入量为：在800ml磷酸钾缓冲液中，加入ATP钠盐0.507g、辅酶A 0.767g、棕榈酸0.512g、乙酰辅酶A合成酶0.38KU。所述ATP钠盐为ATP·2Na。

所述磷酸钾缓冲液的浓度为0.05M，pH值为7.5。

所述调整pH为调整pH至7.5。所述定容为用磷酸钾缓冲液定容至反应混合液的总体积为1L；其中，所述磷酸钾缓冲液的浓度为0.05M，pH值为7.5。

所述反应的条件包括：37℃反应2h；优选的，37℃水浴锅中反应2h。

本发明所述棕榈酰辅酶A的生物化学合成法，只需一步生物化学反应，即可制备出棕榈酰辅酶A，反应时间短，仅需2h就能进行一次反应，效率高。