[发明专利]一种红耳龟特异性引物及其应用在审

专利信息
申请号: 201810190950.3 申请日: 2018-03-08
公开(公告)号: CN108315434A 公开(公告)日: 2018-07-24
发明(设计)人: 龚世平;万小娟;李伟业;葛研;魏玉峰 申请(专利权)人: 广东省生物资源应用研究所
主分类号: C12Q1/6888 分类号: C12Q1/6888;C12N15/11
代理公司: 广州科粤专利商标代理有限公司 44001 代理人: 郝文婷;刘明星
地址: 510260 广东*** 国省代码: 广东;44
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摘要:
搜索关键词: 特异性引物 野外 核苷酸序列 电泳检测 技术支持 快速识别 实验仪器 外来入侵 有效分子 有效手段 环境DNA 快速区 耗材 可用 条带 应用 物种 检测 调查 发现
【说明书】:

发明公开了一种红耳龟特异性引物及其应用。本发明红耳龟特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2所示。本发明红耳龟特异性引物可用于PCR反应并进行电泳检测,通过所得目的条带的有无,快速区分红耳龟与其它11种在中国野外有发现的龟类。本发明通过提供红耳龟特异性引物,并建立区分红耳龟与其它11种龟类的有效分子检测方法,为外来入侵物种红耳龟的快速识别提供了有效手段,该方法对实验仪器和耗材的要求不高,对利用环境DNA调查红耳龟野外分布提供了很好的技术支持。

技术领域

本发明属于物种鉴定技术领域,更具体地说,本发明涉及一种用于快速区分红耳龟与其它11种在中国野外有发现的龟类的红耳龟特异性引物及相应的使用方法。

背景技术

红耳龟Trachemys scripta elegans是世界最危险的100个入侵物种之一,该种目前已在欧洲、非洲和亚洲等地区成功入侵,对入侵地生态环境造成严重破坏,并对社会经济与人类健康构成严重威胁。红耳龟于20世纪80年代开始被引入中国,近些年来已经在中国野外广泛分布,潜在的生态危害十分严重,但针对红耳龟入侵危害的快速识技术与防控技术体系尚未建立,应急防控能力不足。在红耳龟的野外识别方面,常见的方法是野外调查和标本采集或拍照取证,这些方法在很大程度上存在费时费力和不准确性问题,因为红耳龟对人敏感,通常在水体中不易被直接发现,这就制约了红耳龟野外分布快速识别工作的开展。

随着分子生物学技术在物种野外识别方面的应用,近年来利用环境DNA(Environmental DNA)调查动物野外分布及种群密度的技术得到不断发展,该技术可通过检测环境样品中某物种特异DNA片段的有无以判断该物种是否存在,并且可以根据环境DNA浓度来推测动物种群密度,该方法可以在不采集标本或发现动物实体的条件下预测物种分布及其密度,是一种高效的动物野外调查监测技术。红耳龟栖息于淡水环境,针对其生活习性,样品采集主要为淡水环境(河流、池塘和湖泊等),而中国野外同时也有其它一些淡水龟类存在,因此环境DNA可能是多种龟类DNA的混合存在。因此,开发一种红耳龟特异性引物用于环境DNA识别技术非常必要。

在设计目标物种引物时考虑引物的特异性,同时在扩增未知模板时根据目标片段条带的有无把目标种类与其它种类区分开来,此技术也被称为种特异性PCR技术(species-specific PCR,ssPCR)。用于种特异性PCR技术中的基因通常有COI、D-loop及Cyt b等基因。线粒体DNA因其环状特性不易降解,且拷贝数大于核DNA,在环境DNA技术中被应用广泛。其中,COI基因作为目标基因被特异引物扩增时具有高敏感性,它既是目前物种鉴定中使用广泛的分子标记之一,也是环境DNA技术中常用物种分子标记之一。

发明内容

本发明目的在于:提供了一种能快速区分红耳龟与其它11种龟类的红耳龟特异性引物及相应的区分方法。

为了实现上述发明目的,本发明以红耳龟线粒体DNA中的COI基因序列为模板,采用Primer 5软件检查引物错配、二聚体和发夹结构,设计了红耳龟特异性引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2所示。

本发明红耳龟特异性引物可用于快速区分红耳龟与其它11种在中国野外有发现的龟类。

所述其它11种在中国野外有发现的龟类包括(中文名及拉丁文名):乌龟Mauremysreevesii、花龟Mauremys sinensis、黄喉拟水龟Mauremys mutica、安布闭壳龟Cuoraamboinensis、大鳄龟Macroclemys temminckii、蛇鳄龟Chelydra serpentina、平胸龟Platysternon megacephalum、中华鳖Pelodiscus sinensis、山瑞鳖Paleasteindachneri、亚洲鳖Amyda cartilaginea、佛罗里达鳖Apaloneferox。

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