[发明专利]一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法

权利要求书

1.一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法，其特征在于，该方法步骤如下：

1)针对SEQ ID NO:1所示的HMGCR基因片段设计如SEQ ID NO:3所示的CRISPR/Cas9靶标序列，接着合成如SEQ ID NO:6、7所示的带接头的靶标序列及其互补序列，再经退火处理获得gRNA双链DNA片段作为插入片段，将该插入片段克隆至PX459(pSpCas9(BB)-2A-Puro)V2.0载体中，获得靶向HMGCR基因的质粒PX459-HMGCR-gRNA2；

2)将上述质粒转染至PK15细胞中，以1.5μg/ml浓度的嘌呤霉素处理细胞3天进行药筛；提取嘌呤霉素药筛后的细胞基因组DNA，以该提取的DNA为模板，用如SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:9所示的HMGCR基因特异性引物进行PCR扩增，将PCR产物变性、退火后利用T7E1酶进行酶切鉴定。

2.如权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法，其特征在于，所述质粒PX459-HMGCR-gRNA2是以PX459(pSpCas9(BB)-2A-Puro)V2.0质粒为起始载体，先用Bbs1酶切并回收骨架，再合成如SEQ ID NO:6、7所示的两对带有接头的核苷酸序列，合成后稀释并退火作为插入片段；然后用T4 DNA连接酶在16℃连接过夜将骨架和插入片段连接，连接产物转化，挑克隆测序鉴定获得。

3.如权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法，其特征在于，所述PCR反应体系为2x PCR Mix 12.5μl、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示引物各1μl、模板DNA 2μl及ddH₂O 8.5μl。

4.如权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法，其特征在于，所述PCR产物变性、退火条件为95℃5min；94℃2s，-0.1℃/cycle,200times；75℃1s，-0.1℃/cycle,600times；16℃2min。

5.权利要求1所述方法在检测基于HMGCR-gRNAs的CRISPR/Cas9工作效率及单细胞克隆中HMGCR基因敲除鉴定中的应用。

6.权利要求1所述方法在HMGCR基因敲除后的序列分析中的应用。

7.权利要求1所述方法在检测HMGCR基因敲除后mRNA表达水平中的应用。

8.权利要求1所述方法在检测HMGCR基因敲除细胞系是否存在脱靶现象中的应用。

9.权利要求1所述方法获得的HMGCR基因敲除的PK15细胞系。