[发明专利]一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法

说明书

一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法，是设计两个针对HMGCR基因的CRISPR/Cas9靶标序列，体外合成gRNA单链，经过退火处理获得两个gRNA双链DNA目的插入片段，并分别插入PX459(pSpCas9(BB)‑2A‑Puro)V2.0载体中，获得靶向HMGCR基因两个不同位点的质粒；分别转染该两质粒至PK15细胞中，以嘌呤霉素处理细胞，提取处理后的细胞基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物变性、退火后再利用T7E1进行HMGCR基因敲除鉴定。本方法能用于分析HMGCR基因敲除后的序列和mRNA表达情况，能利用PCR结合T7E1酶处理方法验证有无脱靶现象，从而确定基于靶标序列HMGCR‑gRNA的特异性。本方法不仅可应用于细胞、动物模型中实现HMGCR基因的定点敲除，而且对于实现其它基因的敲除具有参考价值，并具有效果好、简便、经济、时间短等优点。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法。

背景技术

CRISPR/Cas系统(clustered,regularly interspaced,short palindromicrepeats-associated protein systems)是细菌及古细菌进化出来用以抵御病毒和质粒入侵的获得性免疫机制。由于该系统具有诸多优势已被广泛应用于基因编辑技术，其强大、高效的基因组编辑功能已被成功应用于多种生物遗传基因改造，包括细菌、植物、秀丽隐杆线虫、斑马鱼、小鼠、大鼠、猪、甚至高等非人灵长类动物。大部分研究都显示，与锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活样效应核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases,TALEN)第一、二代基因编辑技术相比较，CRISPR/Cas系统能更好地识别靶基因，并且CRISPR/Cas9系统结构组成简单，相应地其构建仅需设计、合成一对引物。因此该基因编辑技术具有更高的编辑效率、更简单的操作、更低的成本、更宽广的编辑范围等优势。

CRISPR/Cas9技术是生命科学领域研究技术手段的一个革命性突破，从细菌、植物到哺乳动物诸多物种中都成功实现了应用。在功能基因筛选、转录调控研究、构建遗传基因修饰、抗病毒研究、癌症研究、遗传性疾病研究、单分子标记研究和基因治疗等研究和开发领域中具有广泛的应用。

3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzyme A reductase,HMGCR)，又称羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶，是肝脏通过甲醛戊酸途径合成内源性胆固醇过程中的关键酶或限速酶，在心脑血管/代谢性疾病的发生发展中具有重要功能，也是目前临床常用的他汀类调脂药的主要作用靶点。而近年研究显示，该基因/蛋白还在多种病毒的感染过程中发挥重要作用。

然而迄今为止，尚未见有关利用CRISPR/Cas9系统特异性地将HMGCR基因实现敲除的报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法，该方法能高效、快速、方便地实现在细胞、动物体内敲除HMGCR基因，从而可应用于该基因功能与机制研究，以及相关通路的研究和药物开发。

为达上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法，该方法步骤如下：

1)针对SEQ ID NO:1所示的HMGCR基因片段设计如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的CRISPR/Cas9靶标序列，接着合成如SEQ ID NO:4、5和SEQ ID NO:6、7所示的带接头的靶标序列及其互补序列，再经退火处理获得两个gRNA双链DNA片段作为插入片段，将该两插入片段分别克隆至PX459(pSpCas9(BB)-2A-Puro)V2.0载体中，获得靶向HMGCR基因两个不同位点的质粒PX459-HMGCR-gRNA1和PX459-HMGCR-gRNA2；