[发明专利]基于实时荧光定量PCR技术的脊肌萎缩症致病基因SMN1拷贝数检测试剂盒及方法

权利要求书

1.基于实时荧光定量PCR技术的脊肌萎缩症致病基因SMN1拷贝数检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括如下引物和探针：

引物：SMN1-F:ATAAAGCTATCTATATATAGCTATCTAT/LNA_G/；

引物：SMN1-R:CCTTCTTTTTGATTTTGTCT/LNA_G/；

探针：SMN-P:FAM-ACCCTGTAAGGAAAATAAAGGAAGT-MGB；

封闭探针：SMN2-B:TTCTTTTTGATTTTGTC/LNA_T//LNA_A/AAACCC-C3Spacer；

引物：ALB-F:CCCAGGTTCAAGCCATTCTC；

引物：ALB-R:GACTCTGTCACTTACTGGCGTTT；

探针：ALB-P:CY5-CCTGTTCTTTAGCTATCCGTG-MGB。

其中，SMN1上游引物SMN1-F序列3’端第一位碱基G为锁核酸修饰碱基；SMN1下游引物SMN1-R序列3’端第一位碱基G为锁核酸修饰碱基；SMN2封闭探针SMN2-B3’端第七位A、第八位碱基T为锁核酸修饰碱基，3’端C3Spacer修饰。

2.基于实时荧光定量PCR技术的脊肌萎缩症致病基因SMN1拷贝数检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)制备PCR反应引物和探针混合液，各引物和探针为权利要求1所述的引物和探针，引物和探针的工作浓度为:

引物SMN1-F/SMN1-R/ALB-F/ALB-R:0.25μmol/L

探针SMN-P/ALB-P:0.1μmol/L

封闭探针SMN2-B:0.05μmol/L；

(2)提取人类基因组DNA，紫外分光光度计测量最终浓度为10-30ng/μl；

(3)将包含目的基因SMN1和内参基因ALB扩增片段构进T克隆载体，两者的拷贝数比例为1:1，标准品浓度为1pg/μl；在进行PCR反应之前，将标准品稀释10倍、100倍、1000倍工作浓度，用于标准曲线定量；

(4)进行PCR，PCR反应体系为20μl，各反应组分如下：

阴性对照对照反应中，则将DNA换成ddH₂O；

PCR反应条件如下：

(5)结果分析：标准曲线相关系数R²应大于0.98，目的基因SMN1和内参基因ALB的扩增效率均应在90—105％之间，且相差不超过10％；根据待测样本的Ct值在目的基因SMN1和内参基因ALB标准品的双标准曲线所对应的拷贝数的量，对待测样本在目的基因SMN1和内参基因ALB拷贝数进行定量，计算目的基因SMN1和内参基因ALB拷贝数比值R；根据R值的大小确定目的基因原始拷贝数如下：

R≤0.1时，SMN1基因7号外显子拷贝数为0；

0.35≤R≤0.65时，SMN1基因7号外显子拷贝数为1；

0.80≤R≤1.20时，SMN1基因7号外显子拷贝数为2；

R≥1.35时，SMN1基因7号外显子拷贝数为3以上。