[发明专利]基于实时荧光定量PCR技术的脊肌萎缩症致病基因SMN1拷贝数检测试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种基于实时荧光定量PCR技术的脊肌萎缩症致病基因SMN1拷贝数检测试剂盒及方法，其中包括一对目的基因SMN1基因7号外显子锁核酸修饰的特异引物SMN1‑F(SEQ ID NO.1)和SMN1‑R(SEQ ID NO.2)、SMN1检测探针(SEQ ID NO.3)、SMN‑P锁核酸修饰以及3’端C3Spacer修饰的SMN2基因封闭探针SMN2‑B(SEQ ID NO.4)、内参基因ALB基因引物ALB‑F(SEQ ID NO.5)和ALB‑R(SEQ ID NO.6)、ALB检测探针ALB‑P(SEQ ID NO.7)。通过锁核酸修饰增强SMN1基因扩增特异性及扩增效率，运用多重PCR原理，通过优化反应体系和条件，建立目的基因、内参基因双重扩增的稳定反应体系，可保证SMN1拷贝数定量的精确性和可靠性，重复性好，可操作性强。

技术领域

本发明属于体外核酸检测技术领域，具体为一种基于实时荧光定量PCR技术的脊肌萎缩症致病基因SMN1拷贝数检测试剂盒及方法。

背景技术

脊髓性肌萎缩症(Spinal Muscular Atrophy,SMA)是一种以脊髓前角运动神经元和脑干运动神经元核变性为特征的常染色体隐性遗传的神经肌肉病，是第二大常见致死性常染色体隐性遗传病，发病率约为1/6000-1/10000左右，在人群中的携带率约为1/35-1/50左右。

研究表明，位于5号染色体上的运动神经元存活基因(Survival of MotorNeuron,SMN)，包括端粒端的SMN1和着丝粒端的SMN2，与SMA的发生发展密切相关。其中SMN1的基因缺陷是导致脊肌萎缩症的主要原因，81％～95％的脊肌萎缩症患者是由SMN1基因7号外显子纯合缺失所致。因此，对SMN1基因7号外显子拷贝数进行检测，对SMA患者诊断以及人群携带者筛查具有重要指导意义。但由于SMN1基因与假基因SMN2高度同源，两者间只有五个核苷酸的差异，其中仅一个位于编码区7号外显子(c.840C)，另外四个位6内含子(c.835-44g)，7号含子以及非编码区的8号外显子中，常规方法对于SMN1的检测还存在一些问题。

目前临床上用于SMA辅助检测主要有：限制性片段长度多态性聚合酶链式反应技术(PCR-RFLP)、变性高效液相色谱分析(PCR-DHPLC)、多重连接探针扩增技术(MLPA)、实时荧光定量PCR等。PCR-RFLP法可用于SMN1基因7号外显子纯合缺失患者进行定性分析，但不能检测杂合缺失型的携带者，也有可能存在酶切不彻底造成漏诊或误诊。PCR-DHPLC法、MLPA法可用于检测纯合缺失型患者以及杂合缺失型携带者，但操作复杂、通量低、耗时长、需特定的仪器、且价格较贵，不能用于单细胞检测。早期已有使用实时荧光定量PCR技术来检测SMN1基因7号外显子拷贝数，主要分为两种策略方法：一是直接将引物3’端设计在SMN1基因特异位点c.835-44g或c.840C处，检测探针为SMN探针，但这种常规引物设计并不能完全排除假基因SMN2的非特异扩增，而使相对定量的结果出现偏差。另一种方法为将探针设计在SMN1基因特异位点c.840C处，使用非特异引物进行扩增，当引物进行扩增时，SMN1、SMN2基因同时扩增，而在人群中SMN2基因拷贝数可达2-8个，当SMN1/SMN2拷贝数比值过小时，假基因SMN2的优势扩增将会影响目的基因SMN1的扩增导致结果误差，且探针特异性无法保证。近年来，也有学者，在实时定量PCR技术的基础上，对其进行改进，通过引入公用引物、封闭探针、公用对照品等方式增加SMN1扩增的特异性，但是其操作性相对复杂，成本高。