[发明专利]一种栝楼嫩叶的组培育苗方法

说明书

一种栝楼嫩叶的组培育苗方法，包括外植体抗褐化、消毒处理、叶片愈伤组织诱导培养、丛生芽诱导分化及继代增殖、生根培养和瓶苗移栽等技术环节。本法是以刚萌发的带叶柄嫩叶为外植体，先后用维C、高锰酸钾水溶液浸泡消毒的处理方式，降低外植体褐化率和污染率，使外植体初诱导接种成活率达95%；通过在培养基中添加活性炭和聚乙烯吡咯烷酮来吸附和抑制有害物质，达到提高外植体分化率、降低褐变率的效果。本发明首次采用细胞分裂素与生长组合后直接诱导叶片分化愈伤组织，减少先诱导不定芽分化的环节，提高组培育苗效率；采用苗床覆盖小拱棚的方式定植瓶苗，移栽成活率达90%以上。本方法可为栝楼良种工厂化育苗利用提供技术支撑。

技术领域

本发明涉及通过组织培养技术的植物再生，进一步而言，涉及栝楼嫩叶的组培育苗方法。

背景技术

栝楼（Trichosanthes kirilowii）为葫芦科栝楼属多年生攀援藤本植物，产辽宁、华北、华东、中南、西北、四川、贵州和云南。其根（天花粉）、果实（瓜蒌）、果皮（瓜蒌皮）、种子（瓜蒌仁）均是常用中药材，用于治疗多种疾病。此外，其果实可美容、观赏，种子、根可食用，全株可用于绿化。由于经济价值很高，近年来其种植范围越来越广、种植面积逐步扩大。栝楼为雌雄异株，开花前无明显的形态差异，难以分辩，而种子繁殖的幼苗，雌雄比例约为3：7，而栝楼栽培雌雄植株的合理配比为10∶1，种子苗栽培利用直接影响产量和经济效益。分根繁殖虽然能分辨雌雄株，但繁殖系数低，且种苗容易退化，使发展良种生产受到一定限制。只有通过组织培养技术，才能实现栝楼种苗雌雄株定向培养，解决雌雄株合理配比的问题。目前栝楼组织培养技术研究报道较多，主要存在幼嫩外植体杀菌不彻底，伤口容易褐变，移栽成活率低等问题，导致工厂化组培育苗困难，无法满足规模化生产种苗的需要。

以栝楼顶芽、腋芽、带芽茎段、叶片、块茎幼苗的茎尖和卷须等为外植体选择的研究均有报道，大部分研究表明，带芽茎段是较好的外植体。由于栝楼嫩芽带有绒毛，如果杀菌时间较短，则容易污染，杀菌时间过长，则外植体剪口容易氧化褐变，外植体消毒不彻底导致初诱导不成功是当前栝楼组培育苗技术急需攻克的技术难点之一。大部分研究均采用75%乙醇联合0.1%升汞的植物组织培养常用消毒方法，污染率在5.0%～42.8%；采用5.2%次氯酸钠替代0.1%升汞后，污染率为31.4%；选用75%乙醇联合0.31% 升汞进行外植体消毒，污染率为31%～41%。中国专利申请件CN105191800A《一种栝楼脱毒组培快繁的方法》对腋芽采用42℃热水处理65min后获得脱毒材料，经脱毒炼苗和组织培养后获得脱毒苗，但未对污染率和诱导成活率做具体报道。余慧琳等（2009）将栝楼茎段洗净，切成2cm左右小段，放入高锰酸钾500倍液浸泡40min后，放入新洁尔灭500倍液浸泡30min，再用75%酒精与0.1%升汞或体积比为1∶25的次氯酸钾溶液消毒处理，发现可以减缓外植体的褐化。佟宏霞等（1996）发现，在栝楼初诱导培养基中添加水解酪蛋白有利于外植体抗褐化，添加GA会加速外植体褐化。