[发明专利]一种R-3-氨基丁酸的制备方法

说明书

本发明公开了一种R‑3‑氨基丁酸的制备方法，该方法是以巴豆酸、铵盐为底物，加入含有镁离子的盐，用氨水调节pH，然后加入重组天冬氨酸酶作为生物酶催化剂，在适宜温度和碱性条件下反应，反应后经分离、纯化、结晶，获得R‑3‑氨基丁酸。该方法通过控制反应体系的铵根离子，控制逆反应并减少副产物的生成；利用微滤和纳滤截留菌泥、酶蛋白、硫酸根离子以及色素等杂质，通过连续浓缩结晶，获得高手性纯度以及高杂质纯度的优质产品。

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及天冬氨酸酶催化巴豆酸制备R-3-氨基丁酸的方法。

背景技术

R-3-氨基丁酸(R-3-aminobutyric acid)，CAS：3775-73-3，主要作为医药中间体R-3-氨基丁醇的前体物。R-3-氨基丁醇(R-3-amino-1-butanol)，CAS：61477-40-5，是一种用于治疗艾滋病药物度鲁特韦(Dolutegravir)的关键中间体。度鲁特韦是人类免疫缺陷病毒类型I(HIV-1)整合酶抑制药，其化学合成所需原料较多，R-3-氨基丁酸是其重要原料之一。R-3-氨基丁酸的分子结构式如式(I)所示：

R-3-氨基丁酸经一步还原反应即可得到度鲁特韦关键中间体R-3-氨基丁醇。R-3-氨基丁醇的手性纯度决定了后续合成中间体的纯度，因此，对制备高纯度的度鲁特韦起着举足轻重的作用。目前，国内对于R-3-氨基丁醇的制备主要还是传统的化学方法，包括：化学拆分法、化学诱导法、手性原料合成法和制备色谱法等。但采用以上方法制备R-3-氨基丁醇易对环境造成较大的污染且收率不高，不利于企业的节能减排。

开发具有高效、低成本的路线合成高纯度的R-3-氨基丁酸是降低度鲁特韦原料药成本，推广其应用范围的关键步骤。相对于化学法，生物催化具有反应条件温和、高度选择性、产物纯度高等优点，利用生物酶法催化技术是一种可行的方案，但目前未见关于生物酶法制备R-3-氨基丁酸的相关报道。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种适用于工业生产级别的生物酶催化合成R-3-氨基丁酸的方法。

技术方案：一种R-3-氨基丁酸的制备方法，以巴豆酸、铵盐为底物，加入含有镁离子的盐，用氨水调节pH；加入重组天冬氨酸酶作为生物酶催化剂，在适宜温度和碱性条件下进行生物酶催化反应，反应后经分离、纯化、结晶，获得R-3-氨基丁酸。

该生物酶催化反应如式(II)所示：

巴豆酸即丁烯酸，有顺式和反式两种异构体，本发明所述R-3-氨基丁酸为反式丁烯酸。在该反应中，氨水作为调节pH的碱性物质，又提供了部分铵根离子，在铵盐的作用下，使得该反应能得到充足的铵根离子，同时在反应过程中，pH控制在碱性条件，进一步保证底物巴豆酸能够完全转化为产物R-3-氨基丁酸。

其中，所述重组天冬氨酸酶的获得方法是：将来源于芽孢杆菌的天冬氨酸酶编码基因进行克隆，获得重组质粒，加入感受态宿主细胞进行转化获得工程菌株；然后依次经发酵培养、细胞破碎处理获得；所述重组质粒的核苷酸序列含有如SEQ ID NO.1所述基因序列。

其中，所述重组天冬氨酸酶的获得方法是：以芽孢杆菌菌液为模板，按照GenBank上公开的芽孢杆菌天冬氨酸酶基因序列设计一对引物，随后进行PCR扩增，将PCR扩增片段和载体进行双酶切并纯化，随后按适量的比例将目的片段和载体进行连接构成重组质粒，加入感受态细胞进行转化构成重组菌株，将重组菌株涂布在相应抗性的平板中进行培养。

其中，所述宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母的任意一种。大肠杆菌细胞生长繁殖速度快且BL21(DE3)适用于高效表达外源基因，因此优选大肠杆菌作为宿主细胞。所述重组质粒选用包括但不限于pET、pGEX、pMAL的任意一种作为载体，优选pET-28质粒。