[发明专利]CPS1报告基因干细胞及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种氨甲酰基磷酸合成酶1报告基因干细胞(CPS1报告基因干细胞)的构建方法，包括以下步骤：

1)构建携带CPS1基因的向导RNA(sgRNA)编码序列的骨架载体，简称sgCPS1；

2)构建含有荧光蛋白的CPS1基因的打靶载体；

3)将sgCPS1和CPS1基因的打靶载体转染到多潜能干细胞系中，经筛选获得稳定的荧光标记CPS1的转基因干细胞即CPS1报告基因干细胞。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：

所述步骤1)中构建骨架载体的工具载体包括px458、px330、px461和px333，优选为pX458；以pX458为工具载体构建的携带CPS1基因的sgRNA的骨架载体命名为pX458-sgCPS1，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：构建骨架载体pX458-sgCPS1包括以下步骤：

1.1)设计靶向CPS1基因(GenBank号：1373)的sgRNA，根据CPS1sgRNA序列获得CPS1基因的靶标序列为：AGCTGTGCAGAAATCTCGCA(位于CPS1基因自5’端第4759-4778位碱基)，根据CPS1基因的靶标序列获得CPS1sgRNA编码序列，在CPS1sgRNA编码序列两端加上BbsI酶切序列，最终获得包含CPS1sgRNA编码序列的寡核苷酸序列：

oligo1:5’-CACCAGCTGTGCAGAAATCTCGCA-3’(下划线部分为BbsI酶切序列)，

oligo2:5’-TTTGACGCTCTAAAGACGTGTCGA-3’(下划线部分为BbsI酶切序列)；

1.2)将合成的包含CPS1sgRNA编码序列的寡核苷酸oligo1和oligo2进行退火并磷酸化；

1.3)将工具载体pX458用BbsI进行酶切，回收、纯化酶切工具载体pX458；

1.4)将退火及磷酸化的包含CPS1sgRNA编码序列的寡核苷酸oligo1和oligo2连入经酶切的工具载体pX458中；

1.5)将连接产物转化DH5α感受态细菌，涂布于Amp+培养平板，37℃孵育过夜(16-20小时)；

1.6)从生长出的单克隆细菌中提取重组质粒，得到携带CPS1 sgRNA编码序列的重组骨架载体pX458-sgCPS1。

4.根据权利要求1或2或3所述的构建方法，其特征在于：

所述步骤2)中用于构建CPS1基因打靶载体的出发载体为包含荧光蛋白的原核表达载体，荧光蛋白为tdTomato、GFP、EGFP、YFP等；荧光蛋白为tdTomato的原核表达载体包括pET-tdtomato、pQE-tdtomato、pUC-tdtomato等，优选为pET-tdtomat。