[发明专利]CPS1报告基因干细胞及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种氨甲酰基磷酸合成酶1报告基因干细胞(CPS1报告基因干细胞)及其构建方法与应用。实验证明，利用CPS1报告基因人胚胎干细胞(hESCs)筛选获得的诱导方案可向有效增强肝样细胞诱导分化。本发明可应用于肝向诱导分化体系中诱导剂的筛选中，诱导分化获得的肝样细胞能应用于肝药物代谢研究、肝药物毒性评价，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程领域中的转基因细胞系，特别是涉及一种CPS1报告基因干细胞体系及其构建方法与应用。

背景技术

肝脏是身体内以代谢功能为主的器官，在身体里具有分泌白蛋白、合成储存糖原、清除体内有毒氨等功能，也是最主要的药物代谢器官。肝脏生命活动主要依赖肝实质细胞完成，其数量约占全部肝脏细胞的65％及总肝量的70％-80％。1969年Berry等首次发明了两步灌流法分离原代肝细胞(Berry et al.J Cell Biol.1969,43(3):506-520.)。随着分子生物学、细胞生物学、材料学等学科的发展，分离肝细胞的方法在陆续改进和完善。目前，获得高纯度和高活性的原代肝细胞可应用两步灌流法联合密度梯度离心法(Dalet etal.Anal Biochem.1982,122(1):119-123.)或磁珠分离法(Gailhouste L.Methods MolBiol.2012,826:33-47.)。从尸体肝脏分离人原代肝细胞受到伦理道德的限制，来源非常困难，分离获得的原代肝细胞仅能在培养初期维持较好的形态和功能，持续培养中一些与肝功能相关的重要酶类活性将大量丢失，且原代肝细胞是终末分化细胞，体外很难扩增和传代培养(Yamamoto et al.Hepatol Res.2006,35(3):169-177.)。这些特性极大限制了原代肝细胞的应用，但也促进了应用各种策略获得成熟肝细胞的研究。

目前，可从肝脏干/祖细胞、胚胎干细胞、诱导多能性干细胞、多种成体干/祖细胞诱导分化以及通过谱系重编程从体细胞获得肝细胞。人的胚胎干细胞(hESCs)是从早期胚胎中发现、能在体外培养的一种高度未分化细胞，具有胚胎发育的全能性即具有向3个胚层的组织和细胞分化的特性，在特定条件下可被诱导分化为肝细胞。如何将hESCs向肝细胞诱导分化，并获得具有成熟肝细胞功能的细胞是近年来干细胞研究领域关注的重点。通过序贯加入不同细胞因子和/或小分子组合，不同种属的胚胎干细胞在体外可成功被诱导分化为与成熟肝细胞类似的肝细胞样细胞(Baharvand et al.Int J Dev Biol.2006,50(7):645-652；Cai et al.Hepatol.2007,45(5):1229-1239；Hay et al.Stem Cells.2008,26(4):894-902.)，而人诱导多能性干细胞也可以被相似的方法诱导分化为肝细胞样细胞(Si-Tayeb et al.Hepatology.2010,51(1):297-305；Sullivan et al.Hepatology.2010,51(1):329-335.)。尽管不同的研究团队使用不同的细胞因子和/或小分子组合，不同方案的相同之处都在于采用多步法。因而在各阶段特别是早期阶段，细胞分化方向发生的偏离都会在后续各阶段逐渐累积，并剧烈放大，从而造成诱导效率低下和诱导获得的细胞呈现异质化。这种异质化在干细胞肝向诱导分化中表现为：最终获得的细胞，不仅包括成熟肝细胞，同时也包括肝祖细胞、肝干细胞以及其它中间态细胞。由于中间态细胞不具备肝细胞特有的功能或是肝细胞功能低下，从而使得诱导获得的细胞整体功能低下。如何有效地监测、优化干细胞肝向诱导分化，获得功能较强的诱导肝细胞，是干细胞来源肝细胞应用于研究和临床的重大挑战。

发明内容

本发明的目的是提供一种能肝向诱导分化并获得均质化的诱导肝细胞的氨甲酰基磷酸合成酶1(CPS1)报告基因干细胞及其构建方法。

本发明所提供的氨甲酰基磷酸合成酶1报告基因干细胞(CPS1报告基因干细胞)的构建方法，包括以下步骤：

1)构建携带CPS1基因的向导RNA(sgRNA)编码序列的骨架载体，简称sgCPS1；