[发明专利]人视网膜祖细胞的表型谱

说明书

本发明涉及具有以下阳性表面标记物的人视网膜祖细胞的实质上同质的细胞群：SSEA4、CD73、PTK7和PSA‑NCAM。本发明还涉及利用细胞分选技术从人组织中制备这种实质上同质的细胞群的方法。

本申请为2014年08月06日进入中国国家阶段、申请号201380007641.3、申请日为2013年02月15日、发明名称为“人视网膜祖细胞的表型谱”的发明专利申请的分案申请。

发明背景

人视网膜的退化（无论是由创伤、年龄或疾病导致的）可导致永久性的视力丧失并影响全世界数百万人。退化病症包括，例如，视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性和糖尿病视网膜病变。这些病症的特点在于视网膜的感光细胞的逐渐死亡，并且它们是导致西方世界中不可治愈的失明的主要原因。因为人视网膜的内在再生能力极其有限，因此感光细胞丧失的患者的唯一可行治疗方法就是细胞更换。

几种类型的细胞已被建议作为视网膜退化疾病的细胞疗法手段。这些细胞类型包括人视网膜祖细胞（hRPC）、视网膜色素上皮细胞、神经胶质祖细胞、神经干细胞、来源于骨髓和脐带血的细胞。多能干细胞（也称为祖细胞、未成熟细胞 、前体细胞、未分化细胞或增殖性细胞）是移植和分化的研究热点。

人视网膜祖细胞具有用于临床应用的很大潜力，例如用于移植到退化的或患病的视网膜宿主中。这种细胞通常分离于产前和产后组织中的胎儿视网膜，通过去除睫状边缘带和视神经以消除污染而获得。参见例如U.S.专利号7,514,259，通过引用将其公开内容合并至本文。这些细胞可在体外扩增，并且能够迁移进入视网膜并使得视网膜细胞种群恢复，以形成新的有功能的感光细胞。

在临床应用中，例如对于移植来说，活细胞作为药物产品的使用要求在宿主细胞群扩增期间并在将这些细胞注入受移植人体之前进行全面的细胞表征。这种表征通常通过识别在细胞表面表达的特异性标记物来实现。特异性标记物（即，特定细胞系独特的标记物）的识别对于宿主细胞群的富集或去除也是有用的。

以往已作出许多努力来识别不同细胞类型独特的特异性标记物。已通过这种方式成功表征和识别的细胞群包括造血干细胞、胚胎干细胞、神经干细胞和神经胶质祖细胞。

Carter等在BMC Ophthalmology, 9: 1, 2009中描述了使用CD133标记物来纯化成人视网膜细胞。视网膜细胞悬液来源于人尸体组织，并利用磁性自动化细胞分选来富集。该文献证实了约95%的细胞纯化率。

U.S.专利号6,468, 794描述了利用结合至细胞表面标记物的单克隆抗体来富集神经干细胞和祖细胞的细胞群。U.S.专利号7,015,037描述了对标记物CD44、CD45、HLA I类和HLA II类呈表面阴性的分离的多能干细胞。还可参见U.S.专利号6,908,763、U.S.专利号7,749,754、和U.S.专利号7,781,179，通过引用将这些专利的各自公开内容都合并到本文中。

Yuan等人在Plos One, 6(3), e17540, March 2011中描述了改良的分化和富集程序，其产生来源于多能干细胞的神经干细胞、神经胶质和神经细胞的高度纯化的细胞群。识别了这些细胞上的细胞表面标志或标记物，从而使得能够通过荧光活化的细胞分选而从异质分化的细胞群中分离这些细胞。特别地，该文献提到，神经干细胞的细胞群已通过利用荧光活化的细胞分选（FACS）和以下标记物被成功地分离：CD184+、CD271-、CD44-和CD24+。该公开文献的内容通过引用全部合并至本文中。