[发明专利]一种用于检测甲型、乙型流感病毒的试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种用于检测甲型/乙型流感病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括若干检测管和阳性质控品；其中检测管内包括：PCR缓冲液、海藻糖、牛血清白蛋白、dATP、dUTP、dCTP、dGTP，MgCl₂、HotStart Taq酶、逆转录酶、UNG酶、甲型流感病毒(Influenza A virus)和乙型流感病毒(Influenza B virus)的特异性保守序列的引物及特异性Taqman荧光探针；

所述检测管内的混合试剂经过干燥工艺制成干粉形态，每个检测管检测一个核酸样本；特异性保守序列的引物序列为：甲型流感病毒(Influenza A virus)，SEQ ID NO.1～2；乙型流感病毒(Influenza B virus)，SEQ ID NO.4～5；

所述特异性Taqman荧光探针序列为：甲型流感病毒(Influenza A virus)，SEQ IDNO.3；乙型流感病毒(Influenza B virus)，SEQ ID NO.6；

单个检测管内，含有特异性保守序列的引物序列SEQ ID NO.1～2和特异性Taqman荧光探针序列SEQ ID NO.3；以及特异性保守序列的引物序列SEQ ID NO.4～5和特异性Taqman荧光探针序列SEQ ID NO.6。

2.根据权利要求1所述的一种用于检测甲型/乙型流感病毒的试剂盒，其特征在于，

两条特异性Taqman荧光探针5’端采用不同的荧光报告基团R标记修饰，所述的探针为5’端荧光标记的TaqMan探针，探针两端分别标记荧光报告基团R和荧光淬灭基团Q的寡核苷酸。

3.根据权利要求1所述的一种用于检测甲型/乙型流感病毒的试剂盒，其特征在于，

特异性保守序列的引物序列和Taqman荧光探针序列为：

4.根据权利要求1所述的一种用于检测甲型/乙型流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述各引物在扩增体系中的终浓度为100～1000nM；所述各探针在扩增体系中的终浓度为50～500nM；所述海藻糖在扩增体系中的终浓度为1％～10％；所述牛血清白蛋白在扩增体系中的终浓度为0.1％～5％；所述HotStart Taq酶、逆转录酶、UNG酶在扩增体系中的终浓度为0.5U～5U；所述dATP、dUTP、dCTP、dGTP在扩增体系中的终浓度为0.1mM～2mM；所述MgCl₂在扩增体系中的终浓度为1.5mM～10mM。

5.根据权利要求1所述的一种用于检测甲型/乙型流感病毒的试剂盒，其特征在于，混合试剂经过干燥工艺制成干粉形态，即预装干粉检测试剂；干粉制备工艺为：

将配制好的混合试剂溶液分装到PCR管中，放入-80℃条件下冻存8h以上；

将冻好的混合试剂放入到真空冷冻干燥机中，干燥过程为:

-50℃，1h，1大气压；

-40℃，5h，＜10Pa；

-10℃，2h，＜10Pa；

0℃，2h，＜10Pa；

30℃，5h，＜10Pa；

干燥完成后，得到干粉试剂。

6.根据权利要求1所述的一种用于检测甲型/乙型流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品中含有甲型/乙型流感病毒的扩增基因序列的质粒。

7.权利要求1-6任意一项所述的用于检测甲型/乙型流感病毒的试剂盒的使用方法，该方法包括以下步骤：

(1)将样品DNA/RNA共提取模板、无RNase水、阳性质控品各25μL分别加入不同的检测管中，盖好管盖，进行荧光PCR检测；

(2)PCR扩增反应的条件为：50℃逆转录15～30min；92～97℃预变性1～10min；92～97℃变性10～15s；58～62℃退火35～50s；共40～45个循环；

(3)有效性判定：

无RNase水检测出的Ct值为Undet或40，且阳性质控品检测出的Ct值≤35时判定实验结果有效；否则实验结果视为无效；

(4)结果判读：

样本检测管Ct值为Undet或40，样本结果判断为阴性，样本RNA提取失败、待测样本中不含RNA或含量低于检测限；

样本检测管Ct值≤35，样本结果判断为对应的病原体阳性，样本检测成功；

样本检测管Ct值为38～40，需要复检一次，如果Ct值仍为38～40，则判断为阴性；

按照以上判读方法，结合样本检测管检出的甲型流感病毒和乙型流感病毒对应荧光通道的Ct值来判断两种病毒的检测结果。