[发明专利]L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶及其在催化合成稀有糖D-山梨糖中的应用

说明书

本发明公开了L‑鼠李树胶糖‑1‑磷酸醛缩酶及其在催化合成稀有糖D‑山梨糖中的应用，其基因序列为由SEQ ID NO.1编码的野生型L‑鼠李树胶糖‑1‑磷酸醛缩酶分别经过其氨基酸第115、116、148、188或152位饱和定点突变。本发明通过对RhaD的氨基酸位点进行定点突变，克服了野生型RhaD催化合成D‑山梨糖没有立体选择性的缺陷，实现了RhaD催化D‑甘油醛为醛受体合成D‑山梨糖时的立体选择性，使得催化反应产物以D‑山梨糖为主，经过突变的RhaD的酶活高。本发明方法制备的定点突变的RhaD制备D‑山梨糖，合成效率高、工艺简单、节约成本、D‑山梨糖立体选择性催化效率最高达到91.7％。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶及其在催化合成稀有糖D-山梨糖中的应用。

背景技术

稀有糖是自然界中含量极少且在膳食、保健、医药等领域发挥着重要的生理功能。D-山梨糖(D-sorbose)就是一种稀有糖，且在降低高血糖，高血压，高血脂等方面发挥相当重要的作用。

D-山梨糖在自然界中含量极少且难以通过化学途径合成，目前生产D-山梨糖主要是利用酶固定转化法，即对酶的克隆表达以及产物的分离精制。但粗产品中的D-山梨糖往往与其他糖混合在一起，不仅产率降低，而且D-山梨糖与其混杂的糖理化性质几乎完全相同，所以很难精制与提纯。为了对当前的D-山梨糖合成体系进行优化，就必须提高产品中的D-山梨糖的比率。前期研究表明属于磷酸二羟基丙酮(DHAP)依赖型醛缩酶家族的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶(以下简称RhaD)在以D-甘油醛为醛受体时，失去了对该醛受体的立体选择性，生成D-阿洛酮糖和D-山梨糖两种稀有糖，两者比例接近与1：1。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。

因此，本发明其中的克服现有技术中存在的不足，提供定点突变的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：定点突变的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶，其中：所述定点突变的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶由基因序列为由SEQ IDNO.1编码的野生型L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶分别经过其氨基酸第115、116、148、188或152位饱和定点突变而产生的突变体。

作为本发明所述定点突变的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的一种优选方案，其中：所述其氨基酸第115、116、148、188或152位饱和定点突变而产生的突变体，包括L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的突变体Y152W、突变体Y152Q、突变体Y152N、突变体P188Y、突变体T115A、突变体S116A、突变体I148A。

作为本发明所述定点突变的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的一种优选方案，其中：所述由SEQ ID NO.1编码的野生型L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶来源于大肠杆菌MG1655菌株。

作为本发明的另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供DNA分子。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：DNA分子，其中，所述DNA分子编码权利要求2所述的定点突变的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶。

作为本发明的另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供质粒载体。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：质粒载体，其中：所述质粒载体装载了权利要求4所述的DNA分子。

作为本发明所述质粒载体的一种优选方案，其中：所述质粒载体为在pET-28a载体上装载了权利要求4所述的DNA分子。