[发明专利]一种杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法

说明书

本发明公开了一种杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法，将杂交瘤细胞至于生物反应器中连续二级放大自动化培养，包括对杂交瘤细胞进行一级细胞放大和二级细胞放大。在搅拌通气的条件下大规模自动化培养杂交瘤细胞，具有明显的在线放大细胞优势和连续培养的优势，是大规模自动化细胞培养的最佳途径，工艺合理、蛋白产量和活性高。

技术领域

本发明属于细胞工程技术，尤其是涉及一种杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法。

背景技术

自从1975年Kohler和Milstein建立杂交瘤技术以来，由杂交瘤细胞生产的单克隆抗体已应用到许多方面，特别是在疾病诊断和治疗及亲和层析分离方面，单克隆抗体具有十分诱人的应用前景，其中CD3单抗于1987年被美国FDA批准用于临床，1990年已达到1千万美元的年产值。美国制药工业协会调查报告显示，单抗位列所有医药生物技术产品之首。

随着单克隆抗体的大量应用，杂交瘤细胞的大规模培养技术日趋成熟。英国Celltech公司的1万升气升式反应器已经开发成功，并应用于抗人ABO血型单抗的生产。国内华东理工大学开发的10升规模气升式细胞培养用生物反应器已成功地培养了WuT3杂交瘤细胞。武汉生物制品研究所用70升生物反应器培养WuT3细胞也取得了成功。

目前，杂交瘤细胞的培养已不再以反应器培养规模作为重要的指标，而把更多的精力集中于杂交瘤细胞的代谢调控、反应器的操作模式和控制策略及无血清无蛋白培养技术等方面，以提高杂交瘤细胞密度和单抗的生产率，生产杂蛋白含量低、容易分离纯化的体内用单克隆抗体。

相对于贴壁依赖性细胞，杂交瘤细胞培养的放大可以更多地借助于微生物发酵的经验。八十年代初，已利用生物反应器大规模培养杂交瘤细胞。为了使培养放大工作更加有效，细胞高密度培养的研究引起重视，而首先遇到的则是培养条件的优化，并逐渐过渡到代谢的调控等方面。杂交瘤细胞在生长过程中对pH及渗透压等环境参数十分敏感。鉴于其在融合阶段所采用的细胞的特性，大规模高密度的细胞培养面临的一系列的挑战。我们知道在细胞培养过程中，葡萄糖作为主要碳源及能源物质，被连续摄入并代谢，而代谢副产物乳酸对于培养环境的pH有巨大影响。大细胞大规模培养过程pH是很重要的过程参数，其主要调控手段包括关联补充CO2及NaHCO3进行酸碱调控。而流加培养中也采用降低培养环境中葡萄糖浓度的策略，以促进糖酵解过程向完全氧化的方向进行，以降低乳酸的堆积。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的缺陷而提供一种杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法，本发明采用7L和100L生物反应器进行二级细胞放大培养，在搅拌通气的条件下大规模自动化培养杂交瘤细胞，具有明显的在线放大细胞优势和连续培养的优势，是大规模自动化细胞培养的最佳途径，工艺合理、蛋白产量和活性高。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是提供了一种杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法，将杂交瘤细胞自动化接种于生物反应器中连续二级放大自动化培养，包括对杂交瘤细胞进行一级细胞培养和二级细胞放大。

一级生物反应器细胞培养，经摇瓶制备密度为1.2×10⁶cells/ml的杂交瘤细胞悬液200ml，接种于7L反应器内进行细胞培养。二级生物反应器培养放大，将7L反应器内的细胞悬液作为初始细胞，细胞浓度2～3×10⁶cells/ml，自动输送到100L生物反应器中，收获约80L；蛋白浓度达500mg/L-600mg/L之间。

本发明使用的细胞为杂交瘤细胞，包括哺乳类动物悬浮细胞，BHK悬浮细胞细胞，选择培养的生物反应器是广州齐志生物工程设备有限公司制造的搅拌通气式BC-7L，100L型动物细胞培养生物反应器。