[发明专利]白洗猪LYRM1基因CDS区的克隆方法

说明书

本发明公开了一种白洗猪LYRM1基因CDS区的克隆方法。本发明能简单准确的获得白洗猪LYRM1基因CDS区，为从生物信息学分析LYRM1蛋白的生物特性，为白洗猪的从分子选种培育提供理论依据。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是一种白洗猪LYRM1基因CDS区的克隆方法

背景技术

LYRM1(LYR motif containing l)是应用抑制性差减杂交技术(SSH)筛选肥胖者与健康人群腹膜脂肪组织的差异表达基因时所筛选出的一条新基因，该基因定位于人染色体16p11.2，有4个外显子和3个内含子，mRNA全长1589bp，开放阅读框302-670bp，编码122个氨基酸。邱洁等通过构建了LYRM1绿色荧光蛋白融合载体，LYRM1编码蛋白在细胞中定位于胞核中。前期研究发现该基因高表达于肥胖者脂肪组织，可促进前体脂肪细胞的增殖、抑制前体脂肪细胞的凋亡，过表达LYRM1基因可引起成熟脂肪细胞线粒体形态结构损伤和功能障碍，同时导致成熟脂肪细胞胰岛素刺激下葡萄糖摄取率的降低，朱冠忠等研究表明，LYRM1基因沉默能够引起成熟脂肪细胞Mfn2mRNA表达水平升高，说明LYRM1基因沉默可部分影响成熟脂肪细胞线粒体形态相关基因。陈福坤等发现LYRM1基因具有抑制P19细胞凋亡的作用。寇春兆等研究表明LYRM1基因在骨骼肌细胞中过表达能破坏线粒体形态，降低骨骼肌细胞线粒体的膜电位。林宁等通过对3T3-L1脂肪细胞LYRM1的过表达研究发现其下调了线粒体的代谢关键酶基因的表达水平。梁慎等利用根癌农杆菌介导的T-DNA转化方法，在西瓜枯萎病菌中亦发现了LYRM 1基因对其调控生长发育及其致病性有相关性。

发明内容

本发明的目的是：提供一种白洗猪LYRM1基因CDS区的克隆方法，它操作简单，提取的准确性高。

本发明是这样实现的：白洗猪LYRM1基因CDS区的克隆方法，包括以下步骤：将白洗猪皮下脂肪组织RNA经逆转录获得白洗猪的cDNA，将白洗猪的cDNA经引物PCR扩增获得获得LYRM1基因的CDS区序列，将扩增后产物胶回收后与Pucm-T载体连接，转化进入TOP10感受态细胞进行培养，蓝白斑筛选，选取白色菌落LB液体培养基扩培，PCR检测验证，质粒提取测序验证。

所述的引物包括上游引物F和下游引物R，其序列分别为；

上游引物F的序列：5’-ATGACAACGGCAACACGACAA-3’；

下游引物R的序列：5’-GGAAACCTCATCGTGAGACTG-3’。

所述的PCR反应体系为：所述的PCR扩增的反应总体系20ul:上、下游引物各1.0μL，模板cDNA 1.0μL，2×Es Taq MasterMix 10μL，ddH2O 7μL，PCR的反应条件为：95℃预变性5min；{95℃变性30s，57℃退火15s，72℃延伸30s}×35个循环；72℃终延伸5min，4℃保存。

用质量百分比为1.5％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，切胶回收目的条带和Pucm-T载体连接；连接体系：Pucm-T载体1ul，目的片段5ul，buffer 1ul，T4DNA连接酶1ul，ddH₂O 1ul；将反应混合物在16℃金属浴连接过夜；将反应产物连接到100ul感受态细胞中，培养后选取白色单菌落分别加入盛有AMP抗性的LB液体培养基中，37℃摇床振荡培养12h～16h PCR检测菌液阳性克隆，提取重组质粒测序验证。

由于采用了以上技术方案，本发明能简单准确的获得白洗猪LYRM1基因CDS区，为从生物信息学分析LYRM1蛋白的生物特性，为白洗猪的从分子选种培育提供理论依据。

附图说明

图1LYRM1基因CDS区扩增产物；

图2LYRM1基因的菌液PCR结果；