[发明专利]黑根霉胞外多糖在制备治疗诱发性结肠癌药物中的应用

权利要求书

1.一种黑根霉胞外多糖在制备治疗诱发性结肠癌药物中的应用，其特征在于，所述的黑根霉胞外多糖的制备方法如下：

(1)取菌种保藏号为CGMCC N0.8436的黑根霉菌种接种于PDA培养基中，28±0.5℃活化2-3天后转接至PDB培养基中，在28±0.5℃，100-150rpm/min条件下，连续培养10-12天得发液；

(2)将制备的发酵液以抽滤方法除去菌丝和孢子进行固液分离，将分离后的液体浓缩至原有培养液体积的1/3-1/2；离心收集浓缩液，在收集的浓缩液中加入其3倍体积的无水乙醇静置过夜；离心收集沉淀并用蒸馏水充分溶解，取上清液得粗提液；

(3)将步骤(2)制备的上清液流过装有D301-R型树脂的脱色柱，每次上样200mL，流速为420μL/min，收集脱色后的澄清液；

(4)在步骤(3)制备的澄清液中加入总体积1/4的Sevege试剂置于恒温混匀振荡器中反复多次除去蛋白质，之后以蒸馏方法除去澄清液中的有机溶剂，得到粗多糖溶液；

(5)粗多糖溶液冻干后再经DEAE Sepharose fast flow阴离子交换层析初步分离，得到EPS1；

(6)采用Sephadex G-100和Sephadex G-75葡聚糖凝胶柱层析对DEAE Sepharose fastflow初步分离的多糖EPS1组分进一步分离纯化，得到后续使用的黑根霉胞外多糖EPS1-1。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的黑根霉胞外多糖EPS1-1主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖以及果糖组成，摩尔比为5.89:3.64:3.2:1，分子量为9682Da。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(2)中所述的浓缩为在50-60℃条件下置于旋转蒸发仪中蒸馏浓缩，浓缩至原有培养液体积的1/3。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(4)中所述的Sevege试剂为氯仿和正丁醇按照体积比4:1混合制得。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(5)中所述的DEAE Sepharose fastflow阴离子交换层析步骤为将步骤(4)得到的粗多糖溶液使用冷冻干燥机冻干，取冻干之后的粗多糖10mg溶于1ml水中上样DEAE Sepharose fast flow阴离子交换层析柱，使用pH＝7.4的Tris-HCL为洗脱液洗脱，自动部分收集器进行收集，流速为0.5ml/min，10min收集一管；用苯酚-硫酸法测定糖含量，收集相同组分，透析，分离得到EPS1和EPS2两个组分。

6.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的诱发性结肠癌药物包括药效成分为黑根霉胞外多糖EPS1-1以及药学上可接受的辅料。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的诱发性结肠癌是由化学致癌剂氧化偶氮甲烷(AOM)和葡聚糖硫酸钠(DSS)以及二甲肼(DMH)诱发导致的。