[发明专利]一种提高重组大肠杆菌中1,2,4-丁三醇产量的方法

说明书

本发明公开了一种提高重组大肠杆菌中1,2,4‑丁三醇产量的方法，属于遗传工程领域。本发明是以重组大肠杆菌E.coli W3110ΔyagEΔyjhHΔyiaEΔycdW(pEtac‑mdlC‑tac‑xdh)(ATCC 27325)作为出发菌株，通过构建含有木糖异构酶XylA的反义RNA片段的重组表达载体，抑制木糖分支途径中木糖异构酶的表达水平，加强碳流流向代谢终产物，从而提高1,2,4‑丁三醇产量的方法。最后质粒pEtac‑mdlC‑tac‑xdh‑lac‑asRNA3，使重组大肠杆菌1,2,4‑丁三醇产量提高了44％。

技术领域

本发明涉及一种提高重组大肠杆菌中1,2,4-丁三醇产量的方法，尤其是一种反义RNA抑制分支代谢途径木糖异构酶表达水平提高重组大肠杆菌1,2,4-丁三醇产量的方法，属于遗传工程领域。

背景技术

1,2,4-丁三醇(BT)是一种四碳多元醇，无色，无臭，无味，性质与甘油类似，主要应用于军工、医药、化妆品、化工等领域。目前，1,2,4-丁三醇主要通过化学法生产，但化学法存在反应条件严苛，所用催化剂昂贵，易造成环境污染，副产物较多不利于分离纯化等弊端，故近年来，研究的焦点逐渐转向生物合成法。

迄今为止，生物体内尚未发现1,2,4-丁三醇，生物法合成丁三醇是通过引进外源蛋白构建的合成路径。目前已在大肠杆菌中构建成功且研究较多的合成途径为：从木糖出发，在木糖脱氢酶作用下，生成木糖酸，木糖酸经木糖酸脱水酶，苯甲酰甲酸脱羧酶及醇脱氢酶的作用，生成1,2,4-丁三醇。另外，竞争性分支代谢途径被敲除用以加强流向代谢终产物丁三醇的碳流，但与细胞生长相关的基因如木糖异构酶基因xylA的敲除虽然会提高单位菌体产量，同时也会严重影响细胞生长不利于丁三醇的积累。因此，平衡用于细胞生长及产物合成的碳流，有助于进一步提高1,2,4-丁三醇的产量。

反义RNA(asRNA)是指与mRNA互补的RNA分子，也包括与其它RNA互补的RNA分子。由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异性的互补结合，即抑制了该mRNA的翻译。通过反义RNA控制mRNA的翻译是原核生物基因表达调控的一种方式，最早是在E.coli的产肠杆菌素的Col E1质粒中发现的，许多实验证明在真核生物中也存在反义RNA。近几年来通过人工合成反义RNA的基因，并将其导入细胞内转录成反义RNA，即能条件性地抑制某特定基因的表达，部分阻断该基因的功能。

发明内容

本发明的目的是通过反义RNA技术部分抑制木糖异构酶表达水平，优化用于菌体生长和BT合成的木糖流的分配，进而提高BT产量。本发明依据反义RNA设计原则设计了4条不同长度不同靶基因结合位点的反义RNA，四条反义RNA对目的基因转录水平有不同程度的抑制作用，其中asRNA3和asRNA4的导入显著提高了重组大肠杆菌的1,2,4-丁三醇产量。

本发明首先提供用于提高重组大肠杆菌中1,2,4-丁三醇产量的反义RNA：asRNA1、asRNA2、asRNA3、asRNA4。

编码所述反义RNA的核苷酸序列如下：

asRNA1:

CGGCATTACCTGATTATGGAGTTCAATATGCAAGCCTATTTTGACCAGCTCGATCGCGTTCGTTATGAAGGCTCAAAATCCTCAAACCCGTTAGCATTCCGTCACTACAATCCCGACGAACTGGTGTTGGGTA

asRNA2: