[发明专利]一种重金属抗性微生物的筛选方法

说明书

本发明属于微生物筛选的技术领域，并公开了一种重金属抗性微生物的筛选方法。该方法包括：(a)采集被重金属污染的原位土壤将其分为两份，其中一份预处理后获得原位土壤的浸提液，在该浸提液中添加三羧酸循环底物，并维持添加前后的pH值不变，以此获得培养基基液，将该培养基基液分为两部分，一部分经高压蒸汽灭菌后作为液体培养基，另外一部分作为固体培养基；(b)采用稀释涂布平板法将另外一份原位土壤中的微生物分离获得多个单菌落，从中挑选出所需的菌落并接种到液体培养基中培养，然后保存。通过本发明，获取更多常规方法无法筛选的微生物。

技术领域

本发明属于微生物筛选的技术领域，更具体地，涉及一种重金属抗性微生物的筛选方法。

背景技术

2014年，国家环境保护部、国土资源部联合公布的全国土壤污染状况公报显示，中国土壤污染物点位超标率为16.1％，而其中重金属污染占比超过82.8％，土壤环境状况整体形势较为严峻、重金属污染防治已到了刻不容缓的地步。重金属不能自然降解，其污染具有隐蔽、持续、不可逆的特点，对土壤、大气、水体环境造成了严重的破坏。同时，由于具有高流动性，重金属极易随农产品或受污染水体进入食物链，已严重威胁人类和动物的健康。严峻的重金属污染形势，需求高效、经济的治理手段。微生物可以通过自身生理活动对土壤中的重金属进行吸附、积累和转化，直接或间接影响土壤重金属的行为与归宿；同时，它们与植物具有良好的协同作用，兼具修复土壤重金属污染的能力，两者结合的修复方式，被认为是最具有前途的土壤重金属污染治理技术之一。然而，由于目前99％的微生物尚未纯培养，筛选技术的落后严重制约着微生物修复技术的发展。因此，加强对重金属污染土壤微生物的研究，开发新的筛选技术，对于保障土地可持续利用开发和生态安全，具有重要的科学意义。

环境中大部分微生物不可培养，与微生物之间微妙的相互作用有关，许多微生物的生长必须依赖其他多种微生物的相互协调，其对营养条件的要求通常也非常严格。许多微生物不能直接以常规的碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖等为碳源，而必须依靠其他微生物的代谢产物才能维持生存，因此传统的筛选方式下，这些微生物都不能生长，此外，由于微生物遗传稳定性较差，微生物种群间存在频繁的水平基因转移，致使按照这种方式获得的微生物已经不是纯粹的土著微生物，在实际土壤修复工程中与土著微生物相比没有竞争优势，往往难以维持有效的数量级。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种重金属抗性微生物的筛选方法，该方法通过在土壤浸提液中添加三羧酸循环底物作为微生物的通用碳源，使得所有微生物种群都可以直接获得碳源，不必通过其他微生物的代谢获得，由此解决单菌落不能生长和微生物基因转移的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明，提供了一种重金属抗性微生物的筛选方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

(a)采集被重金属污染的原位土壤，并将其分为两份，其中一份进行预处理后获得所述原位土壤的浸提液，在该浸提液中添加三羧酸循环底物为微生物提供通用碳源，以此获得培养基基液，其中，所述浸提液在添加三羧酸循环底物的前后pH值不变，将所述培养基基液分为两部分，一部分经高压蒸汽灭菌后保存作为液体培养基，另外一部分用于制备固体培养基；

(b)采用稀释法将另外一份原位土壤中的微生物分离后涂布在所述固体培养基上，由此在该固体培养基上获得多个单菌落，从多个单菌落中挑选出所需的菌落并接种到所述液体培养基中培养，然后保存，至此完成微生物的筛选。

进一步优选地，在步骤(a)中，所述预处理包括下列子步骤，

(a1)将所述原位土壤过筛去除杂质；

(a2)将过筛后的原位土壤溶解在去离子水中形成悬浊液；

(a3)将所述悬浊液进行高压蒸汽灭菌，使得所述原位土壤中的可溶性营养物质和重金属充分溶解，以获得接近原位土壤的营养条件和重金属胁迫的土壤初提液；