[发明专利]一种基于免疫磁分离技术和生物发光技术的大肠杆菌的检测方法

说明书

本发明公开了一种基于免疫磁分离技术和生物发光技术的大肠杆菌的检测方法，包括如下步骤：1)将生物素与大肠杆菌抗体偶联，得到生物素化的大肠杆菌抗体；2)生物素化的大肠杆菌抗体和链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒混合，制备磁性纳米探针；3)使用PBS缓冲液冲洗磁性纳米探针后，将磁性纳米探针加入到大肠杆菌溶液中，使大肠杆菌被磁性纳米探针捕获；4)捕获大肠杆菌后的溶液置于离心管中，将捕获有大肠杆菌的磁性纳米探针进行富集；5)采用清洗液对富集的样品进行清洗，得到用于ATP发光的溶液，磁性纳米探针被磁性分离架富集分离；向裂解后的溶液中加入荧光素和Mg²⁺，通过检测溶液的荧光强度，计算得到大肠杆菌的数量。

技术领域

本发明涉及食品安全检测领域，特别是一种基于免疫磁分离技术和ATP生物发光技术 的食品中大肠杆菌数量的检测方法。

背景技术

目前对大肠杆菌的检测方法包括平板稀释法、滤膜法、荧光淬灭法等，这些检测方法都 具有较高的灵敏度，但是都存在一定的不足，如，这些传统方法经常需要1-3天并且需要严 格的实验环境培养细菌，这就决定了这些方法无法满足快速检测的要求。

免疫磁分离技术是食源性致病菌快速筛查技术的重要组成部分之一，该技术可高效捕获、 浓缩增菌液中目标菌，提高致病菌检测灵敏度。近年来，基于磁性微珠的免疫磁分离法(IMS) 将目标菌抗体连接到磁珠上，然后将连有抗体的磁珠投入样品液中对目标菌进行捕获、富集， 磁分离。然而，目前该基于微米级免疫磁珠的分离技术存在磁珠捕获效率低、需要更长的时 间去特异性捕获食品基质中的细菌细胞、微米磁珠单分散性较差，在食品基质液中容易发生 自身聚集或形成沉淀、食品基质性质复杂并且其中非目的致病菌的杂菌浓度大，微米磁珠容 易产生非特异性吸附，难以实现对食品样液中目的菌的特异性分离、微米磁珠的浓度过高会 造成细菌细胞的破损，导致分离的失败、抗体与磁珠表面距离太近，磁珠本身性质及其表面 残留的疏水或强亲水基团容易引起抗体空间构象发生改变，导致抗体生物活性下降等局限。 目前，对大肠杆菌的定量检测尚缺乏快速、准确的技术手段。

发明内容

针对上述现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供一种基于免疫磁分离技术 和生物发光技术的大肠杆菌的检测方法，这两种技术的结合不仅提高了大肠杆菌的捕获效 率，还提高了大肠杆菌数量的测量精度。

为了达到以上目的，本发明的技术方案为：

一种基于免疫磁分离技术和生物发光技术的大肠杆菌的检测方法，包括如下步骤：

1)将生物素与大肠杆菌抗体偶联，得到生物素化的大肠杆菌抗体；

2)生物素化的大肠杆菌抗体和链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒混合，制备磁性纳米探 针；

3)使用PBS缓冲液冲洗磁性纳米探针后，将磁性纳米探针加入到大肠杆菌溶液中，培 养，使大肠杆菌被磁性纳米探针捕获；

4)捕获大肠杆菌后的溶液置于离心管中，在离心管的一侧放置磁性分离架，将捕获有 大肠杆菌的磁性纳米探针进行富集；

5)采用清洗液对步骤4)中富集的样品进行清洗，得到用于ATP发光的溶液，磁性纳米探针被磁性分离架富集分离；

6)向步骤5)中得到的用于ATP发光的溶液中加入ATP擦除剂设定时间后，去除溶液中体细胞和游离ATP，再加入细菌裂解剂，对大肠杆菌进行裂解；

7)向步骤6)中裂解后的溶液中加入荧光素和Mg²⁺，通过检测溶液的荧光强度，计算得到大肠杆菌的数量。

优选的，步骤1)中，生物素与大肠杆菌抗体的摩尔比为1:1。

优选的，步骤2)中，磁性纳米颗粒的粒径为1-100nm，优选为60-80nm。

优选的，步骤3)中，培养的时间为5-15min，优选为10min。